免疫学实验：T淋巴细胞转化试验
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➢ 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构 以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞 和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化 细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+1640 （无FBS)
细胞计数【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1W1640
混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝 小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解
酶标仪测吸光度值： OD490nm
结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
调细胞浓度
1×107个 /ml
2000rpm 10min
加板(三复孔) (加法见附图)
5%CO2 37℃培养48 小时
培养终止前2小时加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔
5% CO2 37℃ 继续培养2小时
实验步骤
➢ 单细胞悬液的制备
1. 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml无血清1640培养液的平皿内。 3. 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网。
T淋巴细胞转化试验
Mar. 5, 2013
主要内容
➢实验分组及材料 ➢实验原理 ➢检测方法 ➢主要操作步骤 ➢结果判定
实验分组及材料
➢分组：每组4人
原理
Lymphocytes(B/T) mitogens Proliferation Nucleic Acid↑ Specificity Ag transformation Protein ↑ lymphoblast
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
G0
有丝分裂原 特异性抗原
G1Leabharlann Baidu
3H-TdR
S
New DNA
Pr,RNA,DNA 前体物质
DNA↑↑
3H-TdR TdR
cpm
SI
ConA 刺激管cpm值 对照管 cpm 值
MTT法
MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是 一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二 苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到 ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢 酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色 的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用 二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜颗粒，其生成量与 细胞数目和/或细胞活性呈正相关，通过检测490nm处 光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
2. 用含血清1640培养液调细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为4ml（此步可使用 之前装无血清培养液的离心管）。
实验步骤
活/增殖 期的细胞
线粒体 能量代谢
MTT掺入
琥珀酸脱氢酶
MTT
还 原
测OD490值
溶解
DMSO
细胞内/周围
甲臢颗粒 formazan
SI
ConA 刺激管OD值 对照管 OD值
操作流程
第一天
1. 杀鼠、 取脾、捣碎、 获得细胞、 计数 2.细胞稀释（1×107）， 上样 （100ul/孔） 3. ConA 的梯度稀释，上样 （100ul /孔） 4.将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO2 37℃ 培养48小时。
T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体， 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。
有丝分裂原
➢ 有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产 物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合， 后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和 诱导细胞分裂。
➢ T和B细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特 异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。这种 转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大， 胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。
常用的丝裂原
➢T cell proliferation
植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)(人T） 刀豆素A（concanavalin, ConA）（鼠T） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
➢B cell proliferation
脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B） 金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein
➢T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和 RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的 细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量 （以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低。 ➢测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器。
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+1640 （无FBS)
细胞计数【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1W1640
混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝 小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解
酶标仪测吸光度值： OD490nm
结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
调细胞浓度
1×107个 /ml
2000rpm 10min
加板(三复孔) (加法见附图)
5%CO2 37℃培养48 小时
培养终止前2小时加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔
5% CO2 37℃ 继续培养2小时
实验步骤
➢ 单细胞悬液的制备
1. 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml无血清1640培养液的平皿内。 3. 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网。
T淋巴细胞转化试验
Mar. 5, 2013
主要内容
➢实验分组及材料 ➢实验原理 ➢检测方法 ➢主要操作步骤 ➢结果判定
实验分组及材料
➢分组：每组4人
原理
Lymphocytes(B/T) mitogens Proliferation Nucleic Acid↑ Specificity Ag transformation Protein ↑ lymphoblast
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
G0
有丝分裂原 特异性抗原
G1Leabharlann Baidu
3H-TdR
S
New DNA
Pr,RNA,DNA 前体物质
DNA↑↑
3H-TdR TdR
cpm
SI
ConA 刺激管cpm值 对照管 cpm 值
MTT法
MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是 一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二 苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到 ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢 酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色 的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用 二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜颗粒，其生成量与 细胞数目和/或细胞活性呈正相关，通过检测490nm处 光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
2. 用含血清1640培养液调细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为4ml（此步可使用 之前装无血清培养液的离心管）。
实验步骤
活/增殖 期的细胞
线粒体 能量代谢
MTT掺入
琥珀酸脱氢酶
MTT
还 原
测OD490值
溶解
DMSO
细胞内/周围
甲臢颗粒 formazan
SI
ConA 刺激管OD值 对照管 OD值
操作流程
第一天
1. 杀鼠、 取脾、捣碎、 获得细胞、 计数 2.细胞稀释（1×107）， 上样 （100ul/孔） 3. ConA 的梯度稀释，上样 （100ul /孔） 4.将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO2 37℃ 培养48小时。
T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体， 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。
有丝分裂原
➢ 有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产 物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合， 后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和 诱导细胞分裂。
➢ T和B细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特 异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。这种 转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大， 胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。
常用的丝裂原
➢T cell proliferation
植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)(人T） 刀豆素A（concanavalin, ConA）（鼠T） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
➢B cell proliferation
脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B） 金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein
➢T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和 RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的 细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量 （以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低。 ➢测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器。