菠萝蛋白酶的制备及活性测定

菠萝蛋白酶的制备及活性测定

背景

菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1．，1964)。1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Martin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruit bromelainE．C．3．4．22．5)。Murachi和Neurath、E1．G harbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。菠萝蛋白酶纯品是一种糖蛋白，分子结构中含有一个寡糖分子，由木糖(xylose，xyl)、岩藻糖(fucose，Fuc)、甘露糖(mannose，Mall)和N一乙酰葡萄胺(N．aceltylglucosamine，GIcNAC)组成

用离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯得到的菠萝蛋白酶进行研究表明，菠萝蛋白酶相对分子量为33200D，等电点为pH9．55，酶液的最大吸收波长为280nm，0．051％浓度的酶液在280nm的光吸收值达0．984(Murachi，et a1．，1964)。分子中有4个N

一乙酰化的氨基己糖，含糖2．1％，分子中有285个氨基酸残基，含氮量为15．88％。在Murachi等研究的基础上，1989年，Ritonja等排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，有20种氨基酸，共212个，C端的氨基酸为谷氨酸(Glu)，N端的氨基酸为丙氨酸(Ala)，相对分子质量为23828。菠萝蛋白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、pH、金属离子等的影响。研究表明(章佩芬等，1999)：菠萝蛋白酶的最适反应温度介于55～60℃，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适pH在6．5～7．5，在7．1附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的pH范围在3．5~4．5；菠萝酶反应影响不大，MgCl2、CaCh对酶有一定程度的抑制作用。生产过程中，为了保护酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保护剂，如EDTA、维生素C、半胱氨酸等，提高酶的活性，延长酶的保存时间。1999年，H．H．Liang 等人研究发现，茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能提高酶的热稳定性，延长酶的半衰期。

1．3菠萝蛋白酶的提取纯化方法．

菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，目前，用于工业化生产的提取方法主要有三种(王平诸等，2002)：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法。

流程

(1)高岭土吸附法工艺流程

菠萝下脚料(压榨)一汁液(高岭土吸附)一吸附物(洗脱、压滤)一洗脱液(盐析)一盐析物(离心)一湿粗酶饼(溶解、过滤)一澄清液(沉淀)一湿酶(干燥)一精品

(2)单宁沉淀法工艺流程

菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(加稳定剂)啼稳定液(加单宁)一单宁沉淀物(洗脱)一滤液(干燥)一酶制品

(3)超滤浓缩法工艺流程

菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(超滤浓缩)一浓缩液(降温、加沉淀剂、沉淀)一湿酶(减压干燥)一酶制品

步骤

2．4．1．1酪蛋白溶液的配制

称取酪蛋白0．609，加0．05mol／L磷酸二氢钠溶液80mL，搅拌溶解后，加0．1mol ／L盐酸液调节pH至7．0，加水至100mL即得。

2．4．1．2酶稀释液的配制

称取L．半胱氨酸0．269，EDTA 0．229，分别加适量水溶解后，调节pH至6．0，加水定容至100mL，即得本液，现配现用。

2．4．1．3三氯乙酸溶液的配制

称取三氯乙酸17．999，加醋酸钠29．949，和冰醋酸18．9mL，加适量水溶解后，加水至1000mL，摇匀，即得。

2．4．1．4磷酸缓冲液

量取0．2 mol／L Na2HP04溶液1 2．3mL与87．7mL 0．2 mol／L NaI--12P04 溶液混合，定容至500ml即得0．05mol／L，pH6．0磷酸缓冲液。

2．4．1．5层析缓冲液

称取1．219 Hs碱，0．589 NaCl，1 mol／L的EDTA lmL，加蒸馏水稀释到1L，用磷酸盐调pH5．0～8．O。梯度洗脱时高浓度氯化钠洗脱液的配制，加氯化钠87．669，至1．50mol／L，其余数据同上。

2．4．1．6 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液

储存液：

①2 mol／L Tris·HCI(pH8．8)，100mL

称取24．29Tris碱，加50mL蒸馏水，．缓慢加浓盐酸至pH8．8，再加蒸馏水至100mL。

②l mol／L Tris-HCI(pH6．8)，100mL

称取12．19秭s碱，加50mL蒸馏水，缓慢加浓盐酸至pH8．8，再加蒸馏水至100mL。

③10％(W／V)SDS，100mL

称取109 SDS，加蒸馏水至100mL，室温保存。

④50％(V厂V)甘油，100mL

倒取甘油(100％)50mL，加入50mL蒸馏水。