胰蛋白酶活性测定教学资料
胰蛋白酶的制备及活力的测定-1
胰蛋白酶的制备及活力的测定-1目的要求1．学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2．了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
实验六胰蛋白酶活力的测定
稀释后Ty（μg/ml） 0
20
40
60
80
100
Na2CO3(ml) 酚试剂(ml)
A680nm
5
5
5
5
5
5
1
1
1
1
1
1
迅速混合，于40℃放置15分钟
调0
以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
2、蛋白酶活力的测定
管号
1号(样 品) 2号(对 照)
酶液 （ml）
1
A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原
因。 如何保证本实验测定数据的准确性？
2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚 试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物， 它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产 生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物,680nm）
3．用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而 推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰 蛋白酶的活力。
4.蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下， 水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
胰蛋白酶的制备及活力的测定
目的要求（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的大体方式。
（2）了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生必然改变后转变成有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为，最适～，在pH=3时最稳固，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳固作用。
重金属离子，有机磷化合物和反映物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发此刻一些植物的块基（如马铃薯、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，关于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
另外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的灵敏性顺序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前经常使用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方式而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一样是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提掏出来，然后再依照等电点沉淀的原理，调剂pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
【医学】胰蛋白酶的活力的测定
操作方法
取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25℃予
热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一 比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀并记时，每半分钟读 数一次，共读3~4分钟。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸 光度随时间的变化率（即初速度）A253/min。
国际系统分类
酶原与酶原激活 无活性的酶前身物称酶原。由无活性酶原 转变为有活性酶的过程称酶原激活。 同工酶 分子结构不同、理化性质也不同，但催化同一化学 反应的一组酶，如乳酸脱氢酶（LDH）。 别位酶 多亚基组成，其中有催化亚基、有调节亚基，小分
子化合物结合调节亚基后分子构象改变，引起催化活性改变。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。 酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0 ，
25℃，反应体积 3.0ml ，光径 1 厘米的条件下，测定 A253 ，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
酶活力与ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ反应速度
初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 时间 15 20
用于判断和确定酶活型中心的主要方法：
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定之青柳念文创作实验目标：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法.实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相毗连的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）.胰蛋白酶所催化的上述反应中，产品BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标.酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程1 cm，波长253nm，温度250C，丈量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位.胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达.这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值.分歧厂家、分歧产品的E1%值有很大不同.E1%值越高，标明酶制剂中酶蛋白含量越高.由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，依照厂家对产品的E1%的测定值配制溶液.在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采取SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描绘是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶尺度溶液可根据厂家的这个说明.器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器.试剂：尺度胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris.1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保管.2)依照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)依照表1的顺序停止测定尺度胰蛋白酶的活性.表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂步调1：空缺调零步调2：样品测定Cl 缓冲液,pH8.0,1.5 mL1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL1.5 mL250C预热5min 250C预热5min胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10μL蒸馏水10 μL 0 μL充分摇匀充分摇匀步调1：∆A253 nm/min调0 -----------步调2：∆A253-nm/min -------------- 记录在步调2样品测定中，加入酶液后当即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min.测得的成果要使△A253nm，若偏离此范围则要适当增减酶量（5μL-20μL之间，空缺试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落为止.3分别求算：1)尺度胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：计算方法：i)胰蛋白酶活性单位数计算：ii)胰蛋白酶比活计算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶暗示比活)实验二胰蛋白酶动力学测定实验目标：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km.实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数.胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键.在本实验中，操纵胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下：反应最适pH8.1,最适温度25 0C.反应产品之一：对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)呈黄色，对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870，但底物BAPA和另外一个产品BA对405nm波长的光基本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm 上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变更.L-BAPA最大浓度低于5104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参数.Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i]，测定每个底物浓度条件下的反应速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是Km/Vmax, 线段的延长线在x轴的截距是-Km，据此可以得到Km和Vmax值；cat=Vmax /[E t].[E t]是酶的初始浓度，已在实验设定为已知,因此cat 可以得出；特异性常数Km/cat可根据上述已知数计算出来.器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器.试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校正）.2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA，蒸馏水溶解并加热到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到100mL. 这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液定名为第六组母液，依照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8mmol/L （第五组母液，25mL）；0.6mmol/L （25mL，第四组母液）；0.4mmol/L （25mL，第三组母液）；0.2mmol/L （10mL，第二组母液）；0.1mmol/L （10mL，第一组母液）. 3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰蛋白酶溶液，该酶的比活104 BAEE 单位/mg蛋白实验步调：1．计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是60g，实验 1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/L ），根据这些值计算加入体系的酶液体积的L数. 2．实验溶液系统：本实验有6组实验组成.实验顺序依照表2的加样程序执行.表2. 测定Km 和Vmax值加样表组BAPA母液浓度（mmol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰蛋白酶（μL）加入60%乙酸（mL）反应体系底物BAPA浓度（mmol/L）νA4051. n[S12 n[S23 n[S34 0. 6 n[S45 n[S56 1 .0 n[S625 0C 保温5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终止反应.反应溶液总量应达到4mL,缺乏部分可加蒸馏水补足.对照试管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液.最后分别记录样品和对照的A405值，每组种二者的差值A405 代入下式即可得到对应于[S i]的i表2列出的是6个实验，鉴于今朝实验室尚没有12个枪头的加样，所以每个实验都可独立停止.[需要特别注意：104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100%，一般可达到95%-97%.在计算动力学参数时，如无特殊切确要求，可依照胰蛋白酶100%的近似值计算.在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml，纯度100%, 每个试管要求加入质量数60g，计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数.2）在停止动力学参数计算时，要停止胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%. 3）如果有求切确, 但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比.然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描成果输入计算软件，依照软件步调，求算胰蛋白酶在全部蛋白样品中的百分比.把实验设定的每个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3，作图求Km，Vmax表3.Hanes 作图的数据[ Si]/νI: [S1]/ν1[S2]/ν2 [S3]/ν3 [S4]/ν4 [S5]/ν5 [S6]/ν6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/对[S]作图可得到一条线段，线段与轴的截距是Km/Vmax，线段延长线与x轴的截距是-Km,根据方程可以得到Km,Vmax根据cat=Vmax/[E t]，求算cat 和Km/cat注意：上式的酶浓度单位是mol/L，已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD，纯度100%停止换算.实验完成后陈述胰蛋白酶的动力参数：Km,Vmax，cat, Km/cat。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰卵白酶活性测定之阿布丰王创作时间：二O二一年七月二十九日实验目的：掌握测定胰卵白酶浓度、活性、比活的原理与方法.实验原理：胰卵白酶相对分子量23.7 KD,主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键,另外还能水解碱性氨基酸形成的酯键, 如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）.胰卵白酶所催化的上述反应中,产物BA对253 nm 的光吸收远年夜于BAEE,因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零,然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量,并把这个增量作为测定胰卵白酶的活性指标.酶活单元界说：在底物BAEE浓度1mmol/L,光程1 cm,波长253nm,温度250C,丈量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单元.胰卵白酶制剂中卵白质浓度含义：胰卵白酶含量一般E1%表达.这个值的含义是：浓度为1% 酶卵白,在1cm光径下,对紫外280nm的消光值.分歧厂家、分歧产物的E1%值有很年夜分歧.E1%值越高,标明酶制剂中酶卵白含量越高.由于酶制剂中卵白质含量各不相同,所以用酶制剂配制E1%的卵白质溶液时,依照厂家对产物的E1%的测定值配制溶液.在本实验中,胰卵白酶酶卵白样品采纳SIGMA 公司生产的产物,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3, 配制胰卵白酶标准溶液可根据厂家的这个说明.器材以试剂：器材,电子天平,紫外分光光度计,微量加样器.试剂：标准胰卵白酶,N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯,HCI, Tris.1．胰卵白酶活性测定：1）配制E1%的胰卵白酶溶液每组取E1%=15.3的胰卵白酶样品10mg 放到1ml去离子水中,充沛溶解后,放入冰中保管.2)依照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)依照表1的顺序进行测定标准胰卵白酶的活性.表1 胰卵白酶活性测定加样顺序试剂步伐1：空白调零步伐2：样品测定Cl 缓冲液,pH8.0,1.5 mL1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL1.5 mL250C预热5min 250C预热5min胰卵白酶:10mg/mL 0 μL 10μL蒸馏水10 μL 0 μL充沛摇匀充沛摇匀步伐1：∆A253 nm/min调0 -----------步伐2：∆A253-nm/min -------------- 记录在步伐2样品测定中,加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时,每半分钟读数一次,共读3～4min.测得的结果要使△A253nm,若偏离此范围则要适当增减酶量（5μL-20μL之间,空白试验相应增减等体积水）后重新测定,一直到△A253nm/min值落为止.3分别求算：1)标准胰卵白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：计算方法：i)胰卵白酶活性单元数计算：ii)胰卵白酶比活计算: (用BAEE单元数/mg胰卵白酶暗示比活)实验二胰卵白酶动力学测定实验目的：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最年夜反应速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km.实验原理：已知胰卵白酶遵守米氏方程,可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数.胰卵白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键.在本实验中,利用胰卵白酶水解酰胺键活性的性质,以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数,反应式如下：反应最适pH8.1,最适温度25 0C.反应产物之一：对硝基苯胺 (p-Nitroaniline,4-NA)呈黄色,对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870,但底物BAPA和另一个产物BA对405nm波长的光基本不吸收, 因此本实验测定光波的波长设在405nm上,把起始反应的吸光值调为0,记录消光值的变动.L-BAPA最年夜浓度低于5104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程,可用Hanes作图法求动力学参数.Hanes作图法是单倒数作图法,把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i],测定每一个底物浓度条件下的反应速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图,可以获得一条线段,线段在y轴的截距是Km/Vmax, 线段的延长线在x轴的截距是-Km,据此可以获得Km和 Vmax值；cat=Vmax /[E t].[E t]是酶的初始浓度,已在实验设定为已知,因此cat可以得出；特异性常数Km/cat可根据上述已知数计算出来.器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计,恒温水浴锅,分析天平,秒表,容量瓶,移液器.试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校正）.2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA,蒸馏水溶解并加热到80 0C以上,完全溶解后置冰水中冷却,定容到100mL. 这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液命名为第六组母液,依照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8mmol/L （第五组母液,25mL）；0.6mmol/L （25mL,第四组母液）；0.4mmol/L （25mL,第三组母液）；0.2mmol/L （10mL,第二组母液）；0.1mmol/L （10mL,第一组母液）.3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰卵白酶溶液,该酶的比活104 BAEE 单元/mg卵白实验步伐：1．计算胰卵白酶加样体积：在本实验中加入胰卵白酶的量是60g,实验 1 已经测到胰卵白酶的比活和浓度（g/L）,根据这些值计算加入体系的酶液体积的L数.2．实验溶液系统：本实验有6组实验组成.实验顺序依照表2的加样法式执行.表2. 测定Km 和Vmax值加样表组BAPA母液浓度（mmol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰卵白酶（μL）加入60%乙酸（mL）反应体系底物BAPA浓度（mmol/L）νA4051. n[S12 n[S23 n[S34 0. 6 n[S45 n[S56 1 .0 n[S625 0C 保温5 min后,摇匀,秒表计时,准确反应2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液,摇匀终止反应.反应溶液总量应到达4mL,缺乏部份可加蒸馏水补足.对比试管不加入胰卵白酶,只加入0.4mL 60%的乙酸溶液.最后分别记录样品和对比的A405值,每组种两者的差值A405 代入下式即可获得对应于[S i]的i表2列出的是6个实验,鉴于目前实验室尚没有12个枪头的加样,所以每一个实验都可自力进行.[需要特别注意：104 BAEE u/mg protein的胰卵白酶制剂,纯度范围是90%-100%,一般可到达95%-97%.在计算动力学参数时,如无特殊精确要求,可依照胰卵白酶100%的近似值计算.在本试验中,可根据浓度胰卵白酶浓度10mg/ml, 纯度100%, 每个试管要求加入质量数60g,计算出每个试管加入的胰卵白酶溶液微升数.2）在进行动力学参数计算时,要进行胰卵白酶质量-摩尔数转换,如无特殊要求,也可以把胰卵白酶纯度近似为100%.3）如果有求精确, 但产物说明没有给出胰卵白酶在固形物中的百分含量,就需配制一定浓度的固形物溶液,首先测定卵白质浓度,通过求算卵白质总量,获得卵白质在酶制剂中的重量比.然后通过双向电泳,图像扫描,把扫描结果输入计算软件,依照软件步伐,求算胰卵白酶在全部卵白样品中的百分比.把实验设定的每一个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3,作图求Km,Vmax表3.Hanes 作图的数据[ Si]/νI: [S1]/ν1[S2]/ν2 [S3]/ν3 [S4]/ν4 [S5]/ν5 [S6]/ν6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/对[S]作图可获得一条线段,线段与轴的截距是Km/Vmax,线段延长线与x轴的截距是-Km,根据方程可以获得Km,Vmax根据cat=Vmax/[E t], 求算cat 和Km/cat注意：上式的酶浓度单元是mol/L, 已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰卵白酶相对分子量23,7 KD,纯度100%进行换算.实验完成后陈说胰卵白酶的动力参数：Km,Vmax,cat, Km/cat 时间：二O二一年七月二十九日。
胰蛋白酶活力测定
实验胰蛋白酶活力测定一、原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器试管7220分光光度计恒温水浴锅三、实验试剂福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml10%三氯乙酸溶液0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。
500ug/L 酪氨酸溶液 胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：0.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液654321管号各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂0 OD68011福林试剂B 5.05.0 0.55mol/L碳酸钠溶液37水浴中显色15分钟11上清液过滤3.03.0 10%三氯乙酸溶液1.00 2mg/ml胰酶溶液01.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液37水浴中酶解15分钟2.02.0 0.5%酪素溶液备注21管号五、结果计算酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定一、实验目的1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。
二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，排毒养颜胶囊用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定之袁州冬雪创作实验目标：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法.实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相毗连的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）.胰蛋白酶所催化的上述反应中，产品BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标.酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程1 cm，波长253nm，温度250C，丈量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位.胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达.这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值.分歧厂家、分歧产品的E1%值有很大不同.E1%值越高，标明酶制剂中酶蛋白含量越高.由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，依照厂家对产品的E1%的测定值配制溶液.在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采取SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描绘是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶尺度溶液可根据厂家的这个说明.器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器.试剂：尺度胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris.1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保管.2)依照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)依照表1的顺序停止测定尺度胰蛋白酶的活性.表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂步调1：空缺调零步调2：样品测定Cl 缓冲液,pH8.0,1.5 mL1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL1.5 mL250C预热5min 250C预热5min胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10μL蒸馏水10 μL 0 μL充分摇匀充分摇匀步调1：∆A253 nm/min调0 -----------步调2：∆A253-nm/min -------------- 记录在步调2样品测定中，加入酶液后当即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min.测得的成果要使△A253nm，若偏离此范围则要适当增减酶量（5μL-20μL之间，空缺试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落为止.3分别求算：1)尺度胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：计算方法：i)胰蛋白酶活性单位数计算：ii)胰蛋白酶比活计算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶暗示比活)实验二胰蛋白酶动力学测定实验目标：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km.实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数.胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键.在本实验中，操纵胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下：反应最适pH8.1,最适温度25 0C.反应产品之一：对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)呈黄色，对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870，但底物BAPA和另外一个产品BA对405nm波长的光基本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm 上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变更.L-BAPA最大浓度低于5104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参数.Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i]，测定每个底物浓度条件下的反应速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是Km/Vmax, 线段的延长线在x轴的截距是-Km，据此可以得到Km和Vmax值；cat=Vmax /[E t].[E t]是酶的初始浓度，已在实验设定为已知,因此cat 可以得出；特异性常数Km/cat可根据上述已知数计算出来.器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器.试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校正）.2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA，蒸馏水溶解并加热到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到100mL. 这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液定名为第六组母液，依照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8mmol/L （第五组母液，25mL）；0.6mmol/L （25mL，第四组母液）；0.4mmol/L （25mL，第三组母液）；0.2mmol/L （10mL，第二组母液）；0.1mmol/L （10mL，第一组母液）. 3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰蛋白酶溶液，该酶的比活104 BAEE 单位/mg蛋白实验步调：1．计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是60g，实验 1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/L ），根据这些值计算加入体系的酶液体积的L数. 2．实验溶液系统：本实验有6组实验组成.实验顺序依照表2的加样程序执行.表2. 测定Km 和Vmax值加样表组BAPA母液浓度（mmol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰蛋白酶（μL）加入60%乙酸（mL）反应体系底物BAPA浓度（mmol/L）νA4051. n[S12 n[S23 n[S34 0. 6 n[S45 n[S56 1 .0 n[S625 0C 保温5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终止反应.反应溶液总量应达到4mL,缺乏部分可加蒸馏水补足.对照试管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液.最后分别记录样品和对照的A405值，每组种二者的差值A405 代入下式即可得到对应于[S i]的i表2列出的是6个实验，鉴于今朝实验室尚没有12个枪头的加样，所以每个实验都可独立停止.[需要特别注意：104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100%，一般可达到95%-97%.在计算动力学参数时，如无特殊切确要求，可依照胰蛋白酶100%的近似值计算.在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml，纯度100%, 每个试管要求加入质量数60g，计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数.2）在停止动力学参数计算时，要停止胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%. 3）如果有求切确, 但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比.然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描成果输入计算软件，依照软件步调，求算胰蛋白酶在全部蛋白样品中的百分比.把实验设定的每个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3，作图求Km，Vmax表3.Hanes 作图的数据[ Si]/νI: [S1]/ν1[S2]/ν2 [S3]/ν3 [S4]/ν4 [S5]/ν5 [S6]/ν6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/对[S]作图可得到一条线段，线段与轴的截距是Km/Vmax，线段延长线与x轴的截距是-Km,根据方程可以得到Km,Vmax根据cat=Vmax/[E t]，求算cat 和Km/cat注意：上式的酶浓度单位是mol/L，已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD，纯度100%停止换算.实验完成后陈述胰蛋白酶的动力参数：Km,Vmax，cat, Km/cat。
实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定
实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定目的要求1．学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2．了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目标：控制测定胰蛋白酶浓度.活性.比活的道理与办法.实验道理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD,重要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相衔接的肽键,此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键, 如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）.胰蛋白酶所催化的上述反响中,产品BA对253 nm 的光接收弘远于BAEE,是以可以在实验肇端点把253 nm 的消光值调为零,然跋文录反响体系对253 nm 的消光值的增量,并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标.酶活单位界说：在底物BAEE浓度1mmol/L,光程1 cm,波长253nm,温度250C,测量体积3mL,.前提下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位.胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度寄义：胰蛋白酶含量一般E1%表达.这个值的寄义是：浓度为1% 酶蛋白,在1cm光径下,对紫外280nm的消光值.不合厂家.不合产品的E1%值有很大不同.E1%值越高,标明酶制剂中酶蛋白含量越高.因为酶制剂中蛋白质含量各不雷同,所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时,按照厂家对产品的E1%的测定值配制溶液.在本实验中,胰蛋白酶酶蛋白样品采取SIGMA 公司临盆的产品,临盆公司对展品的描写是对280nm紫外接收值15.3, 配制胰蛋白酶尺度溶液可依据厂家的这个解释.器材以试剂：器材,电子天平,紫外分光光度计,微量加样器.试剂：尺度胰蛋白酶,N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯,HCI, Tris.1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中,充分消融后,放入冰中保管.2)按照表1 的请求配制实验体系所需其它各类溶液.3)按照表1的次序进行测定尺度胰蛋白酶的活性.表1 胰蛋白酶活性测定加样次序试剂步调1：空白调零步调2：样品测定Cl 缓冲液,pH8.0,1.5 mL1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL1.5 mL250C预热5min 250C预热5min胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10μL蒸馏水10 μL 0 μL充分摇匀充分摇匀步调1：∆A253 nm/min调0 -----------步调2：∆A253-nm/min -------------- 记载在步调2样品测定中,参加酶液后立刻盖上盖敏捷混匀计时,每半分钟读数一次,共读3～4min.测得的成果要使△A253nm,若偏离此规模则要恰当增减酶量（5μL-20μL之间,空白实验响应增减等体积水）后从新测定,一向到△A253nm/min值落为止.3分离求算：1)尺度胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：盘算办法：i)胰蛋白酶活性单位数盘算：ii)胰蛋白酶比活盘算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶暗示比活)实验二胰蛋白酶动力学测定实验目标：初步控制以下几个酶动力学参数测定与求算办法：米氏常数Km,最大反响速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km.实验道理：已知胰蛋白酶遵照米氏方程,可以经由过程测定底物浓度与反响速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数.胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键.酰胺建和酯键.在本实验中,应用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质,以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数,反响式如下：反响最适pH8.1,最适温度25 0C.反响产品之一：对硝基苯胺 (p-Nitroaniline,4-NA)呈黄色,对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870,但底物BAPA和另一个产品BA对405nm波长的光根本不接收, 是以本实验测定光波的波长设在405nm上,把肇端反响的吸光值调为0,记载消光值的变更.L-BAPA最大浓度低于5104mol/L时这个酶促反响相符米氏方程,可用Hanes作图法求动力学参数.Hanes作图法是单倒数作图法,把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i],测定每一个底物浓度前提下的反响速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图,可以得到一条线段,线段在y 轴的截距是Km/Vmax, 线段的延伸线在x轴的截距是-Km,据此可以得到Km和 Vmax值;cat=Vmax /[E t].[E t]是酶的初始浓度,已在实验设定为已知,是以cat可以得出;特异性常数Km/cat可依据上述已知数盘算出来.器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计,恒温水浴锅,剖析天平,秒表,容量瓶,移液器.试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校订）.2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA,蒸馏水消融并加热到80 0C以上,完整消融后置冰水中冷却,定容到100mL. 这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液定名为第六组母液,按照慢慢稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8mmol/L （第五组母液,25mL）;0.6mmol/L （25mL,第四组母液）;0.4mmol/L （25mL,第三组母液）;0.2mmol/L （10mL,第二组母液）;0.1mmol/L （10mL,第一组母液）.3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰蛋白酶溶液,该酶的比活104 BAEE 单位/mg蛋白实验步调：1．盘算胰蛋白酶加样体积：在本实验中参加胰蛋白酶的量是60g,实验 1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/L）,依据这些值盘算参加体系的酶液体积的L数.2．实验溶液体系：本实验有6组实验构成.实验次序按照表2的加样程序履行.表2. 测定Km 和Vmax值加样表组BAPA母液浓度（mmol/L）参加BAPA母液（mL）参加Tris-HCI（mL）参加胰蛋白酶（μL）参加60%乙酸（mL）反响体系底物BAPA浓度（mmol/L）νA4051. n[S12 n[S2[S33 n[S44 0. 6 n5 n[S5[S66 1 .0 n25 0C 保温 5 min后,摇匀,秒表计时,精确反响2min后参加0.4mL 60%的乙酸溶液,摇匀终止反响.反响溶液总量应达到4mL,缺少部分可加蒸馏水补足.对比试管不参加胰蛋白酶,只参加0.4mL 60%的乙酸溶液.最后分离记载样品和对比的A405值,每组种两者的差值A405 代入下式即可得到对应于[S i]的i表2列出的是6个实验,鉴于今朝实验室尚没有12个枪头的加样,所以每一个实验都可自力进行.[须要特别留意：104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂,纯度规模是90%-100%,一般可达到95%-97%.在盘算动力学参数时,如无特别精确请求,可按照胰蛋白酶100%的近似值盘算.在本实验中,可依据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml, 纯度100%, 每个试管请求参加质量数60g,盘算出每个试管参加的胰蛋白酶溶液微升数.2）在进行为力学参数盘算时,要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换,如无特别请求,也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%.3）假如有求精确, 但产品解释没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量,就需配制必定浓度的固形物溶液,起首测定蛋白质浓度,经由过程求算蛋白质总量,得到蛋白质在酶制剂中的重量比.然后经由过程双向电泳,图像扫描,把扫描成果输入盘算软件,按照软件步调,求算胰蛋白酶在全体蛋白样品中的百分比.把实验设定的每一个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3,作图求Km,Vmax表3.Hanes 作图的数据[ Si]/νI: [S1]/ν1[S2]/ν2 [S3]/ν3 [S4]/ν4 [S5]/ν5 [S6]/ν6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/对[S]作图可得到一条线段,线段与轴的截距是Km/Vmax,线段延伸线与x轴的截距是-Km,依据方程可以得到Km,Vmax依据cat=Vmax/[E t], 求算cat 和Km/cat留意：上式的酶浓度单位是mol/L, 已知酶浓度是10mg/ml,须要依据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD,纯度100%进行换算.实验完成后陈述胰蛋白酶的动力参数：Km,Vmax,cat, Km/cat。
胰蛋白酶活性测定之欧阳光明创编
实验一胰蛋白酶活性测定欧阳光明（2021.03.07）实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程 1 cm，波长253nm，温度250C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1%值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1%的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N- 苯甲酰-L- 精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE ）水解为H- 苯甲酰-L- 精氨酸（BA ）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA 对253 nm 的光吸收远大于BAEE ，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE 浓度1m mol/L ，光程 1 cm ，波长253nm ，温度25 0C ，测量体积3mL,. 条件下吸光值每分钟递增0.001 （A/min=0.001 ）为1 个BAEE 酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般 E 1% 表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm 光径下，对紫外280nm 的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1% 的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的 E 1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品, 生产公司对展品的描述是对280nm 紫外吸收值15.3 ，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L- 精氨酸乙酯，HCI, Tris 。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1% 的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3 的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml 去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2) 按照表 1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3) 按照表 1 的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
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胰蛋白酶活性测定实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE 酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂步骤1：空白调零步骤2：样品测定0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL250C预热5min 250C预热5min 胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10 μL蒸馏水10 μL 0 μL充分摇匀充分摇匀步骤1：∆A253 nm/min 调0 -----------步骤2：∆A253-nm/min -------------- 记录在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。
测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5μL -20μL之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落在0.05～0.100之间为止。
3分别求算：1)标准胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：计算方法：i)胰蛋白酶活性单位数计算：ii)胰蛋白酶比活计算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶表示比活)实验二胰蛋白酶动力学测定实验目的：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度Vmax,转换数κcat,特异性常数κcat,/Km。
实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数。
胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键。
在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下：反应最适pH8.1,最适温度25 0C。
反应产物之一：对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4 -NA)呈黄色，对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870，但底物BAPA和另一个产物BA对405nm波长的光基本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm 上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变化。
L-BAPA最大浓度低于5⨯104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参数。
Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i]，测定每一个底物浓度条件下的反应速度νi,然后用[Si]/νi 对[Si]作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是K m/V max, 线段的延长线在x轴的截距是-Km，据此可以得到K m和 V max值；κcat=V max / [E t]。
[E t]是酶的初始浓度，已在实验设定为已知,因此κcat可以得出；特异性常数Km/κcat可根据上述已知数计算出来。
器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。
试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）：取 0.2mol/L Tris（Mr=121.14）100mL与0.2mol/L HCI 52.4mL混匀，加入0.8gCaCl2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校正）。
2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA，蒸馏水溶解并加热到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到100mL。
这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液命名为第六组母液，按照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8m mol/L （第五组母液，25mL）； 0.6m mol/L （25mL，第四组母液）；0.4m mol/L （25mL，第三组母液）；0.2 m mol/L （10 mL，第二组母液）；0.1 m mol/L （10mL，第一组母液）。
3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰蛋白酶溶液，该酶的比活〉1.0⨯104 BAEE 单位/mg蛋白实验步骤：1．计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是60μg，实验1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（μg/μL），根据这些值计算加入体系的酶液体积的μL 数。
2．实验溶液系统：本实验有6组实验组成。
实验顺序按照表2的加样程序执行。
表2. 测定K m和V max值加样表组BAPA母液浓度（mmol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰蛋白酶（μL）加入60%乙酸（mL）反应体系底物BAPA浓度（m mol/L）νA4051. 0.1 样品1,2.0对照 1, 2.0 1.51.6n0.40.4[S1]0.052 0.2 样品2, 2.0对照2, 2.0 1.51.6n0.40.4[S2]0.13 0.4 样品3, 2.0对照3, 2.0 1.51.6n0.40.4[S3] 0.24 0. 6 样品4, 2.0对照4, 2.0 1.51.6n0.40.4[S4]0.35 0.8 样品5, 2.0对照5, 2.0 1.51.6n0.40.4[S5]0.46 1 .0 样品6, 2.0对照6, 2.0 1.51.6n0.40.4[S6]0.525 0C 保温5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终止反应。
反应溶液总量应达到4mL,不足部分可加蒸馏水补足。
对照试管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液。
最后分别记录样品和对照的A405值，每组种两者的差值∆ A405 代入下式即可得到对应于[S i]的νi表2列出的是6个实验，鉴于目前实验室尚没有12个枪头的加样，所以每一个实验都可独立进行。
[需要特别注意：1）比活大于1.0⨯104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100%，一般可达到95%-97%。
在计算动力学参数时，如无特殊精确要求，可按照胰蛋白酶100%的近似值计算。
在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml，纯度100%, 每个试管要求加入质量数60μg，计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数。
2）在进行动力学参数计算时，要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%.3）如果有求精确, 但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比。
然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描结果输入计算软件，按照软件步骤，求算胰蛋白酶在全部蛋白样品中的百分比。
把实验设定的每一个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3，作图求K m，Vmax表3. Hanes 作图的数据[ Si]/ νI : [S1]/ν1 [S2]/ν2 [S3]/ν3 [S4]/ν4 [S5]/ν5 [S6]/ν6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/ν对[S]作图可得到一条线段，线段与轴的截距是Km/Vmax，线段延长线与x 轴的截距是-Km,根据方程可以得到Km,Vmax根据κcat=V max/[E t]，求算κcat 和K m/κcat注意：上式的酶浓度单位是mol/L，已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD ，纯度100%进行换算。
实验完成后报告胰蛋白酶的动力参数：Km, Vmax，κcat, Km/κcat。