胰蛋白酶活力测定
酶活力测定方法
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
实验六胰蛋白酶活力的测定
稀释后Ty（μg/ml） 0
20
40
60
80
100
Na2CO3(ml) 酚试剂(ml)
A680nm
5
5
5
5
5
5
1
1
1
1
1
1
迅速混合，于40℃放置15分钟
调0
以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
2、蛋白酶活力的测定
管号
1号(样 品) 2号(对 照)
酶液 （ml）
1
A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原
因。 如何保证本实验测定数据的准确性？
2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚 试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物， 它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产 生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物,680nm）
3．用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而 推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰 蛋白酶的活力。
4.蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下， 水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
猪胰蛋白酶酶活力的测定
猪胰蛋白酶酶活力的测定实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
生化实验报告胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定一、实验原理1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅三、实验试剂1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)四、实验步骤1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数五、实验结果由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数胰蛋白酶活力为：0.8 /15 ╳13=0.69六、实验分析1. 测定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。
酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。
1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。
1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。
7 胰蛋白酶活力的测定
中国海洋大学实验报告姓名庞裕智专业年级生命基地班2011 题目胰蛋白酶活力的测定学号040312011025 科目生物化学实验时间周一90节同组者田特一、实验目的学习和掌握胰蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
三、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅四、实验试剂、1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)五、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂六、实验结果酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由标准曲线知，当OD680=0.244时，样品中酪氨酸的微克数为A=181ug ∴样品中胰蛋白酶活力单位为181/15×13=156.87七、实验分析1.注意事项（1）胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；（2）要在酶的最适温度40℃下反应；（3）要在酶的最适PH为7.5调节下反应；（4）催化反应的时间控制精确；（5）向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；（6）加入各种药品的量要精确，特别是酶。
胰蛋白酶抑制因子的测定方法
胰蛋白酶抑制因子的测定方法：称取1g 样品( 液体也以质量称取), 每1g 样品用50ml 0.01 mol/L 的氢氧化钠溶液提取3h( 搅拌),样品的最大用量约为1g 。
分别吸取0 、0 . 6 、1 . 0 、1 . 4 、1 . 8 、2 . 0ml 的上层提取液注入2 组试管中, 并加水稀释至2ml. 分别加入2ml 胰蛋白酶溶液于每支试管中, 混匀。
在加入5ml 预热至37 ℃的BAPNA溶液,并严格地于10min 后加入1ml 醋酸溶液并混匀,已停止反应。
将内容物过滤, 并于410nm 出测定光密度值。
对于空白对照管, 是取2ml 样本提取液加5ml BAPNA试剂并保温在37 ℃10min , 然后加入1ml 醋酸溶液及2ml 胰蛋白酶溶液.活力的表示方法：一个胰蛋白酶单位(AU), 是10ml 反映溶液在本文叙述的条件下,于410nm 处测得反映前后所增加0.01光密度为1 单位( Absorbance Unit),胰蛋白酶抑制剂活力用胰蛋白酶抑制剂单位( TLU) 表示。
结果计算：用TLU ml 对分析所用提取液体积( ml)做标准曲线,并外推到零。
每克样品的TLU 值=延伸值×稀释倍数, 当用分析的提取液的TLU ml 对分析液体积做图并不是直线关系时，则计算出每单位体积提取液中TLU 平均值, 则TLU g 样品=平均值×稀释倍数。
试剂：0 . 05mol/ L tris - CaCl2 溶液( 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液) pH: 8 . 2 溶解6 . 05g 三羟甲基氨基甲烷及2 . 94gCaCl2 . H2O 于约900ml 蒸馏水中, 调节至pH 为8 . 2 ,并用蒸馏水稀释成1L.底物溶液：称取40mg BAPNA溶于1ml 二甲基亚砜中,并用已预热到37 ℃的tris-CaCl2 溶液稀释成100ml 。
胰蛋白酶溶液:称取4mg 胰蛋白酶(不含盐) 溶于200ml 0.001mol/L的HCl 中。
胰蛋白酶比活力测定的实验操作
胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。
测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。
下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。
实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。
2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。
3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。
4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。
5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。
6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。
实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。
用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。
2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。
黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。
通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。
数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。
2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。
注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。
2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。
3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。
胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
胰蛋白酶 药典标准
胰蛋白酶药典标准
胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，可用于提高肠道消化功能，改善胃肠道疾病。
胰蛋白酶的药典标准是按照国家药典制定的，以下是胰蛋白酶药典标准的相关参考内容：
【名称】胰蛋白酶
【药典标准】
1. 性状：胰蛋白酶为白色或几乎白色的粉末，无臭。
2. 酶活力测定：胰蛋白酶的酶活力以消化明胶法测定。
3. 蛋白含量测定：胰蛋白酶的蛋白含量以紫外吸收光度法测定。
4. 储存条件：胰蛋白酶应密封保存于阴凉干燥处，避免阳光直射。
【净含量】胰蛋白酶的净含量应符合生产商标注，一般以毫克或克为单位。
【适应症】胰蛋白酶广泛用于胃肠道消化功能减退，如慢性胰腺炎、胰腺切除术后，以及胃肠道手术后等。
【用法用量】成人常规剂量为每次口服胰蛋白酶20000-30000
单位，饭前或饭时服用。
具体剂量应根据患者消化功能及病情而定。
【不良反应】胰蛋白酶在正常剂量下一般不会引起不良反应，少数患者可能出现过敏反应如发热、皮疹、荨麻疹等，此时应停药并及时就医。
【注意事项】
1. 对胰蛋白酶过敏者禁用。
2. 胰蛋白酶可能与一些抗酸药物相互作用，如需要联用应在医生指导下进行。
3. 儿童、孕妇、哺乳期妇女及老年患者应在医生指导下使用。
【贮存期限】胰蛋白酶的贮存期限以生产商标注为准，一般为2-3年。
【生产企业】胰蛋白酶的生产企业应符合相关法规要求，具有药品生产许可证。
以上是胰蛋白酶药典标准的一些相关参考内容。
胰蛋白酶在临床上被广泛应用于改善消化功能减退的患者，但使用时应遵循医生的指导，且注意可能的不良反应和禁忌症等。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
胰蛋白酶
能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀， 易于引流排除，加速创面净化，促进肉 芽组织新生，此外还有抗炎症作用。 临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃 疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部 水肿、血肿及脓肿等。 喷雾吸入，用于呼吸道疾病。 也可用于治疗毒蛇咬伤。 还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
适应条件
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞 离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。 胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有 关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用 能力最强。 使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化 过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白 质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不 含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止 消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰 酶对细胞的作用。
基本作用
在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏 是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为 胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的 限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶， 它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基 侧切断。 它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜 蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前 体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在 决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少 的工具。
胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白 水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算，每 1mg 的效价不得少于2500单位。 由牛、羊、 猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖 氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或 米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘 油、氯仿和乙醚。分子量24 000，pI 10.5， 最适pH值7.8～8.5左右。pH>9.0不可逆失活。 Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机 磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活 性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿
酶活力测定的原理和方法
• 3、甲醛滴定法：用蛋白酶水解蛋白质生 成氨基酸。再用甲醛固定氨基酸的氨基， 用0.1N NaOH滴定生成的氨基酸的量，从 而测定酶活力。
• 4、DHT—酪蛋白法：用5-氨基四唑重氮盐将酪 蛋白中部分组氨酸和酷氨酸重氮化，得到黄色 的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以 DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生 成DHT-肽。二价镍离子可与DHT-蛋白及DHT-肽 形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅 速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合 适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂， 利用比色法可测定蛋白酶活力。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
十、胰蛋白酶的活力测定
• 测定时，取底物溶液3.0mL，加盐酸 （0.001mol/L）0.2mL混匀，作为空白。取供 试品溶液0.2mL与底物溶液（预热至25±0.5℃） 3.0mL，立即计时并摇匀，使比色池内的温度 保持在25±0.5℃，在253nm波长处，每隔30s 读吸收度，共5min。以吸收度为纵坐标，时间 为横坐标作图，取在3min内成直线部分的吸收 度计算分析。
• 1、福林—酚法：蛋白酶催化蛋白质水解 生成氨基酸。其中含酚基的氨基酸(酪氨 酸、色氨酸等)与福林—酚试剂反应，生
成蓝色复合物。蓝色深浅与含酚氨基酸
的量成正比，从而测定其活力。
蛋白质活性测定方法
核糖核酸酶（RNase）的活性测定（1）溶液的配制：①0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液：称取5.78 g CH3COONa, 加入1.7 mL CH3COOH, 用蒸馏水稀释至500 mL。
② 0.05 % RNase酵母溶液：称0.05 g RNase酵母，用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液溶解并稀释至100 mL。
测活方法：（2）用移液管移取已配制好的0.05 %的核糖核酸酵母溶液2.5 ml于比色皿中，加入一定量的样品RNase A溶液，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在300 nm波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，得到一组对应于时间t(min)的At值。
当样品管反应3小时后再测定300 nm处的吸光值A f, A f为最终的光吸收，分别求得一组对应于t的log(A t-A f), 以log(A t-A f)对时间t作图应得到线性关系，画出直线。
求出直线斜率的数值S，将S带入标准曲线，求得活性回收率。
将S带入下列公式中，可求出酶的活力。
单位/ mg = S × (-2.3) ×4 / (样品管中含酶的数量)胰凝乳蛋白酶（α-Chy）活性测定用胡梅尔(Hummel)法测定α-胰凝乳蛋白酶[2]：(1) 原理：α-胰凝乳蛋白酶优先催化水解结合有氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的L-异构体）的肽键。
我们可以通过在256 nm处测定吸光度增大值的办法来测定反应的速度。
苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解反应引起吸光度的增大。
(2) 定义：一个凝乳蛋白酶单位相当于在pH值为7.8，温度为25 ℃时，每分钟水解1 μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。
(3) 试剂配置方法：Tris缓冲液(pH: 7.8)取0.969 g三（羟甲基）氨基甲烷和1.47 mg二水氯化钙溶于80 mL蒸馏水中，用1 N的盐酸将pH值调至7.8，并定容至100 mL。
实验十一 注射用胰蛋白酶效价测定
实验十一注射用胰蛋白酶效价测定一、实验目的1掌握胰蛋白酶活力的测定方法-酶速率测定法。
2掌握紫外分光光度计的原理和使用方法。
二、实验原理N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进行测定的原理是：N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L-精氨酸。
在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L-精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收随之相应增加。
2010版药典指出胰蛋白酶注射剂中含胰蛋白酶的活力单位应为标示量的90.0%-120.0%；若按干燥品计箅，则每1mg中胰蛋白酶的活力不得少于2500单位。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25℃，测量体积3ml,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
三、试剂与器材1.材料胰蛋白酶注射剂：规格（1)1. 2 5万单位（2)2. 5万单位（3)5万单位(4)10万单位N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐2.试剂(1)0.001mol/L盐酸溶液：取12mol/L的浓盐酸83.33ml与916.67ml蒸馏水混合。
(2)0. 067mol/L磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾9.112g溶于1000ml蒸馏水中。
(3)0. 067mol/L磷酸氢二钠溶液：取磷酸二氢钠8.04g溶于1000ml蒸馏水中。
(4)磷酸盐缓冲液：0. 067 m o l / L磷酸二氢钾溶液13mL与0. 067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合，pH值为7. 6。
3.器材试管及试管架、移液管、100ml容量瓶、紫外分光光度计等。
四、实验步骤1.底物溶液的制备取N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg，加水溶解使成100m l，作为底物原液；取10ml，用磷酸盐缓冲液稀释成100ml ，用紫外- 可见分光光度法（附录IV A ) ，恒温于25. 0°C ± 0 . 5°C ，以水作空白，在253nm的波长处测定吸光度，必要时可用上述底物原液或磷酸盐缓冲液调节，使吸光度在0. 575-0. 585之间，作为底物溶液。
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胰蛋白酶活力测定
一、目的
了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。
二、原理
1）福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
2）蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
三、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
四、实验试剂
1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)
2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml
3、10%三氯乙酸溶液
4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：
5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液
7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)
五、实验步骤
1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：
管号 1 2 3 4 5 6
500ug/m
L酪氨
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
酸溶液
蒸馏水 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
2、
管号7 8 备注
0.5%酪素溶液 2.0 2.0 37水浴中酶解15分钟
0.2mol/l磷酸缓冲液 1.0 0
2mg/ml胰酶溶液0 1.0
10%三氯乙酸溶液 3.0 3.0 过滤
上清液 1 1 37水浴中显色15分钟
0.55mol/L碳酸钠溶液 5.0 5.0
福林试剂B 1 1
OD680 0 0.190
3、以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线
六、实验结果
组别 1 2 3 4 5 6 样液
吸光度1 0 0.237 0.367 0.576 0.690 0.852 0.38 吸光度2 0 0.234 0.365 0.573 0.680 0.848 0.38 吸光度3 0 0.237 0.367 0.577 0.688 0.847 0.38 平均吸光度0 0.236 0.366 0.575 0.686 0.849 0.38
酪氨酸含量（µg)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Y
酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
所以样液中酪氨酸含量为y=0.597×0. 38-0.02=0.20686微克
酶活力单位为0.20686/15*13=0.17928
七、实验分析
1、酶的实验为何设置对照又设置空白？
空白：紫外误差读书范围在0,3~0.7或者0.3~0.8，用水调零做空白，吸光度就可落在此范围，用对照管做空白就会有较大的误差。
对照：是为了抵消α-酮戊二酸的干扰
2、如何保证本实验测定数据的准确性？
所有测得的数据落在0.1到0.8之间且数据值逐渐增加时，本实验测定的数据就是准确的。
胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；要在酶的最适温度40℃下反应；要在酶的最适PH为7.5调节下反应；催化反应的时间控制精确；向1号试管加入三氯醋酸时要快；加入各种药品的量要精确，特别是酶.
3、稀释的酶液是否可以长期保存？为什么？
不可以，酶是蛋白质且易失活，会被细菌等分解。