胰蛋白酶活力测定

胰蛋白酶活力测定

一、目的

了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。

二、原理

1）福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。

2）蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。

三、实验仪器

1、试管

2、7220分光光度计

3、恒温水浴锅

四、实验试剂

1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)

2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml

3、10%三氯乙酸溶液

4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：

5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。

6、500ug/L酪氨酸溶液

7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)

五、实验步骤

1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：

管号 1 2 3 4 5 6

500ug/m

L酪氨

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

酸溶液

蒸馏水 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

2、

管号7 8 备注

0.5%酪素溶液 2.0 2.0 37水浴中酶解15分钟

0.2mol/l磷酸缓冲液 1.0 0

2mg/ml胰酶溶液0 1.0

10%三氯乙酸溶液 3.0 3.0 过滤

上清液 1 1 37水浴中显色15分钟

0.55mol/L碳酸钠溶液 5.0 5.0

福林试剂B 1 1

OD680 0 0.190

3、以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线

六、实验结果

组别 1 2 3 4 5 6 样液

吸光度1 0 0.237 0.367 0.576 0.690 0.852 0.38 吸光度2 0 0.234 0.365 0.573 0.680 0.848 0.38 吸光度3 0 0.237 0.367 0.577 0.688 0.847 0.38 平均吸光度0 0.236 0.366 0.575 0.686 0.849 0.38

酪氨酸含量（µg)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Y

酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。

样品中含酶活力单位=A/15 ╳F

A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数

F—酶液稀释倍数

所以样液中酪氨酸含量为y=0.597×0. 38-0.02=0.20686微克

酶活力单位为0.20686/15*13=0.17928

七、实验分析

1、酶的实验为何设置对照又设置空白？

空白：紫外误差读书范围在0,3~0.7或者0.3~0.8，用水调零做空白，吸光度就可落在此范围，用对照管做空白就会有较大的误差。

对照：是为了抵消α-酮戊二酸的干扰

2、如何保证本实验测定数据的准确性？

所有测得的数据落在0.1到0.8之间且数据值逐渐增加时，本实验测定的数据就是准确的。胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；要在酶的最适温度40℃下反应；要在酶的最适PH为7.5调节下反应；催化反应的时间控制精确；向1号试管加入三氯醋酸时要快；加入各种药品的量要精确，特别是酶.

3、稀释的酶液是否可以长期保存？为什么？

不可以，酶是蛋白质且易失活，会被细菌等分解。