九基因的克隆与表达

1. 氯化钙转化法
2. 电击转化法
电击法不需要预先诱导细菌进入感受态，只
依靠短暂的电击，促进 DNA 进入细胞。因其操
作简单方便、转化率亦高，愈来愈为人们接受。
3. 体外包装转染法
利用噬菌体颗粒能够将自身DNA 有效地注入到 寄生菌细胞内的原理，将λ噬菌体头部及尾部蛋白与 λ DNA 重组体混合，组装成完整的噬菌体颗粒，再 来感染大肠杆菌。研究发现每微克重组λ DNA 直接
转染细菌，可产生103-4个噬菌斑；如用体外包装的具
感染力的λ噬菌体颗粒，每微克可产生106个噬菌斑，
比不包装裸露的重组λ DNA 效率增加100倍。
4. 受体细胞的选择
受体细胞是重组基因增殖的场所。对受体细胞
也应具有几个要求： ①容易接纳重组分子； ②对
载体的复制扩增无严格限制； ③不存在特异的内
LB + MgSO4 LB
Charon
EMBL3 λgt10
LE392 C600
LE392 C600 hflA
LB + MgSO4
LB + MgSO4 LB + MgSO4
pGEM
λ gt11
JM105 JM109
Y1090 BNN97
LB/Ap
LB/Ap + MgSO4
四. 重组体的筛选与鉴定
1. 抗生素平板等筛选
• （提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在 10U/μL左右，3μL内切酶相当于30U，足够切 10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－ 600ng/μL，一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶 切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）
• 2.1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法 ) • 1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用 1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。 2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断 （插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦 拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒， 而后切胶回收。） 3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20 分钟。 4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端， 两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径 3mm左右的平头，准备用于碎胶。
酶切
5’-GAATT 3’-CTTAA
受体
CC-3’ GG-5’
供体
5’-GAATTCC-3’ 3’-CTTAAGG-5’ EcoR Ⅰ
BamH Ⅰ 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
酶切
Taq Ⅰ(或Cla Ⅰ) 5’-TCGA-3’ 3’-AGCT-5’
酶切
5’-G 3’-CCTAG
切酶体系降解外源 DNA； ④不对外源 DNA 进行
修饰； ⑤符合“重组 DNA 操作规则”安全标准。
常用载体所用的宿主细胞
载体
pBR322
宿主细胞
LE392 HB101 JM107 JM109
培养基
LB/ 抗菌素
pUC系列
λ噬菌体 M13
JM103
LE392 JM103 JM107 JM109
LB/Ap
• 1.酶切 配置可酶切共10μL质粒的酶切反应体系（双酶切）： （提示 在克隆设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效 价高、便宜量大的酶>，且注意这两个酶有比较兼容的 Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大< 至少保持60%的活性>。酶切体系根据需要，可加入 BSA。）
•
• 酶切体系 A质粒酶切－制作载体片断 公用Buffer 3μL 酶 I 1μL 酶 II 1μL 质粒 3μL 双蒸水 22μL 合计 30μL B质粒酶切－制作插入片断 公用Buffer 7μL 酶 I 2μL 酶 II 2μL 质粒 7μL 双蒸水 52μL 合计 70μL 混匀。37℃，酶切3小时。
• 9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、 20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤 离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分 钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机 相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反 应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉 淀核酸，并且无需洗盐。） 10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。 室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风 干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻 弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹 风.）
填平末端
5’-GGATC 3’-CCTAG
连接
GATCT-3’ CTAGA-5’ 5’-GGATCGATCT-3’ 3’-CCTAGCTAGA-5’ Cla Ⅰ
3、T-A克隆
• pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用 载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位 点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用 EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。
⑴ 插 入 失 活
⑴ 插 入 失 活
⑵ 插入表达 质粒 pTR262 携带有来自λ噬菌体 的 CⅠ基因， 它是 Tetr 基因的负控制系统。在正常情况下，CⅠ基
因表达产生阻遏物，使Tetr 基因不能表达，表现Tets
表型。如果在 CⅠ基因的 Hind Ⅲ或 Bcl Ⅰ位插入外 源 DNA 片段，将导致CⅠ基因失活，Tetr解阻遏而表 达，这时即表现Tetr表型。由这样的重组 DNA 转化 细胞，在Tet平板上可以生长，而未消化或自身成环
利用载体的表型特征或遗传标记直接筛选。如：
质粒、粘粒具有抗药性标记，它们转化宿主细胞后，
都能在含有抗菌素 (Amp或Tet)的培养板上生长；而
未转化的宿主细胞则不能生长。这样可从大量的细
胞群体中筛选出转化子与非转化子。对于噬菌体来 说，噬菌斑的形成就是他们自我选择的特征。对于 重组子与非重组子的筛选则用:
选择以 DNA 为模板，通过扩增后得到含内含子和调控顺序
在内的完整基因；又可选择以 RNA 为起始材料，经逆转录 成 cDNA，扩增后得到无内含子，无调控顺序，只有结构
Hale Waihona Puke Baidu
基因的核酸片段。通过 PCR 扩增可获得目的 DNA或其中
某一特定顺序，用于亚克隆、酶切分析、建立 cDNA 文库 或作为探针。PCR技术的诞生，使分子克隆中 DNA 操作变 得更为快捷和准确。
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端 多加一个A
三. 重组基因导入细胞
在基因克隆技术中，将质粒 DNA 及其重组体 导入细菌称为转化( transformation )；病毒及其重组 体导入受体细胞称为转染( transfection )；噬菌体及
其重组体导入受体细胞称转导( transduction )。
2. 限制性内切酶图谱鉴定
3. 外源基因的序列分析
• 附:一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接 • 简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切 3μL ，要切出小片断的质粒B酶切7μL；琼脂糖回 收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来 自B的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收 DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。
基因克隆的基本程序
一. 分离或合成外源基因
1. 直接从染色体 DNA 中分离
一些 DNA物理图谱已经确定，背景资料比较清 楚的原核生物，可以采用直接分离法分离制备目的基 因。从原核生物中提取纯化DNA 之后，根据它的限 制性核酸内切酶物理图谱进行基因定位，便能很方便 地从该 DNA限制性核酸内切酶消化片段的电泳凝胶 上回收目的基因。但是，对于真核生物 DNA 分子大， 染色体数目多，采用直接法制备目的基因比较困难。
3. 从基因文库(gene library)筛选
基因文库是指用重组DNA技术将某种生物细 胞的总 DNA 的所有片段随机地连接到载体上，然 后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖构成 各 DNA 片段的克隆，当制备的克隆数目多到可以
把某种生物的全部遗传信息都包含在内的情况下，
这一组克隆的总体就被称为该种生物的基因文库。 因此，目的基因可以从基因文库中筛选获得。
填平
CGA-3’ T-5’
填平
5’-GGATC 3’-CCTAG
受体
CGA-3’ GCT-5’
供体
5’-GGATCCGA-3’ 3’-CCTAGGCT-5’ BamH Ⅰ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ BamH Ⅰ 5’-G 3’-CCTAG
填平末端
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bgl Ⅱ GATCT-3’ A-5’
• 5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平 头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮， 不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时 就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶） 6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。 7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。 8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇 （24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖 紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
２. 从 mRNA 合成 cDNA
目的基因可以通过纯化的 mRNA 经逆转录合成 获得。例如网织细胞合成的蛋白质，90%是血红蛋白 ( Hb) 的α、β链。用抗Hb的抗体与网织细胞中分离出
来的多聚核糖体一起保温，使多聚核糖体沉淀出来，
再从其中可分离到Hb的mRNA。纯化mRNA的在逆
转录酶催化下可以得到Hb的cDNA 。
的质粒转化细胞及未转化细胞是不能生长的。
⑶ β-半乳糖苷酶显色反应 pUC 系列、pEGM 系列、M13 中引入了编码 LacZ 基因的α肽顺序，其中含有多克隆酶切位点。当无外 源基因片段插入时，质粒表达α肽，它与宿主菌编码 N-末端α-多肽缺陷的β-半乳糖苷酶多肽发生基因互补， 形成有活性的β-半乳糖苷酶，在含有底物 X-gal 和诱 导剂 IPTG 的存在下，菌落呈蓝色；如果LacZ 基因 中插入外源基因，造成插入失活，使之不能产生α多 肽，转化细胞失去了α-互补，将无β-半乳糖苷酶活性 存在，因此在X-gal 平板上，阳性重组子为白色菌落。
4. 从 cDNA 文库中筛选
上述用某种生物体总 DNA 建造的文库，由于包含了该 生物体的全套基因，因此它实际上是该生物基因组(genome) 文库, 即gDNA文库。同样可有染色体基因组文库、叶绿体 基因组文库、噬菌体基因组文库等文库。 如果把某种生物细胞全部 mRNA 抽提出来，再通过逆 转录产生总 cDNA，用上述 gDNA 文库构建的方法，可以 获得该种生物细胞的 cDNA 文库。由cDNA 文库也可以筛选 出所需的目的基因。 cDNA 文库与gDNA文库不同，它只包 含表达蛋白质或多肽的基因，不包括内含子和其它不表达 的 DNA 序列。
5. 人工合成基因
一些简单的多肽（如生长抑制素，含14个氨基 酸），可以在已知其一级结构的基础上，按这些 氨基酸编码的核苷酸系列来合成基因。
6. PCR扩增目的基因
从文库中分离目的基因虽然有效，但都存在步骤多、费时、
筛选工作量大等困难，而且更为重要的问题是往往不能获 得完整的全长基因。PCR 技术可根据研究目的不同，既可
二
.
目 的 基 因 与 载 体 重 组
1
.
粘⑴ 性同 末源 端互 连补 接粘
性 末 端 连 接
⑵ 非 同 源 互 补 粘 性 末 端 连 接
(
定 向 克 隆 ）
2. 平端连接
EcoR Ⅰ 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
酶切
Hae Ⅲ
5’-G 3’-CTTAA
填平
5’-GGCC-3’ 3’-CCGG-5’
• 九.基因的克隆与表达
• 基因的克隆 • 基因的表达
基因克隆（分子克隆molecular cloning） ----通过体外重组技术,将一段目的DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受 体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。
基因克隆的技术路线 目的基因 载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA