九基因的克隆与表达
基因工程技术在生物药物开发中的关键步骤与注意事项
基因工程技术在生物药物开发中的关键步骤与注意事项生物药物的开发和生产对于人类健康和医疗事业具有重要意义。
基因工程技术在生物药物开发中扮演着关键的角色，它们能够帮助科学家改变生物体的基因组，从而产生具有特定功能的药物分子。
1. 基因克隆与表达基因克隆与表达是生物药物开发的关键步骤之一。
首先，科学家需要从目标生物体中提取出特定基因，并利用限制性内切酶等方法将其截取下来。
接下来，需将截取得到的基因与载体DNA连接，合成重组DNA。
随后，重组DNA会被转入宿主细胞，细胞会利用重组DNA中的信息合成特定蛋白质。
2. 蛋白质纯化与分析蛋白质纯化和分析是确保生物药物质量和纯度的重要步骤。
通过使用离心、层析、电泳等多种技术，科学家可以从宿主细胞中分离和纯化目标蛋白质。
同时，利用质谱技术和其他生物化学分析方法，可以对蛋白质进行特性分析，确保其结构和功能的正确性。
3. 转基因生物体的制备在生物药物开发过程中，转基因生物体的制备也是一个关键步骤。
通过基因工程技术，科学家可以将目标基因导入到特定宿主生物体中，使其能够表达出特定的蛋白质。
在这一过程中，科学家需要注意选择恰当的宿主生物体，并进行适当的基因转导和筛选，以获得高产量和高质量的生物药物。
4. 转基因技术的安全性在进行基因工程技术时，科学家需要关注转基因技术的安全性。
诸如转基因生物体的抗性筛选、遗传稳定性测试、基因组稳定性等评估都是非常重要的。
此外，必须进行严格的控制和监测，以确保生产的生物药物没有外源的有害物质和微生物污染。
5. 临床试验与监管生物药物开发中的最后一步是进行临床试验和监管。
这些试验对于评估药物的安全性和有效性至关重要。
在进行临床试验时，科学家应遵循伦理原则和临床试验规范，确保试验的合规性和结果的可靠性。
此外，政府和药品监管机构应加强对生物药物生产、质量控制、临床试验等环节的监管和管理，以保障患者的用药安全。
在实施基因工程技术的过程中，还需要关注以下注意事项：1. 遵循伦理原则：开展基因工程研究和生物药物开发需要严格遵循伦理原则，确保科研工作的道德性和合法性。
牙鲆sox9基因的克隆与表达研究
第29卷第1期2011年1月海洋科学进展ADVANCES IN MARINE SCIENCE Vol.29No.1Januar y,2011牙鲆sox9基因的克隆与表达研究*文爱韵1,2,尤锋1,*,孙鹏1,徐冬冬1,吴志昊1,马得友1,李军1,张培军1(1.中国科学院海洋研究所海洋生物学重点实验室,山东青岛266071; 2.中国科学院研究生院,北京100039)摘要:通过Genome walking 方法克隆得到了牙鲆(P a r alichthys olivaceus)sox9的基因组全长序列,对其在成鱼各组织的差异表达进行了RT -PCR 分析。
结果显示:牙鲆sox9基因全长3573bp,包含3个外显子和2个内含子,编码的蛋白全长478aa,含有高度保守的H MG 结构域;sox9基因在性腺的表达具有两性差异,精巢中的表达明显强于卵巢中的表达,属1个性别相关基因,但其在肝脏、心脏、鳃、脑、眼和胃等多种组织中也有不同程度的表达。
据此进一步分析和讨论等sox9基因在牙鲆性腺发育中的作用。
关键词:牙鲆(P a ra lichthys olivaceus);sox9;基因克隆;两性差异表达中图分类号:Q344文献标识码:A 文章编号:1671-6647(2011)01-0097-08sox9基因属于sox 基因家族,其编码的蛋白质在H MG(H igh mobility group box)保守盒内与哺乳类雄性性别决定基因sr y 的相似性大于60%[1],故该基因也应与性别相关。
研究表明,哺乳类sox9基因发生突变后有75%的雄性个体发育为中性或雌性。
该基因受到其上游的sr y 的转录调节[2],并在性腺中调控着下游基因的表达。
如sox9下调wnt4(wingless -type MMT V integration site family,member 4)的表达,性腺将发育成睾丸[3];sox9也可以参与激活amh(ant-i Mullerian hor mone)[4],使哺乳动物性腺向着精巢方向发育[5]。
基因的克隆与表达PPT课件
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二．原核生物基因结构和表达特点
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1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
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3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
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五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
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1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
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三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
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四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
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2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
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➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
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基因克 隆 Gene Cloning
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➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
IAA家族九个基因的克隆和表达分析的开题报告
陆地棉Aux/IAA家族九个基因的克隆和表达分析的开题报告一、研究背景植物生长调节是植物生长发育的重要调控机制。
IAA (Indole-3-Acetic Acid) 作为一种内源性植物生长素能够影响植物的生长、发育、开花、果实发育等过程。
而Aux/IAA家族基因则是调控IAA作用的一类关键基因。
陆地棉 (Gossypium hirsutum L.) 是一种重要的经济作物，其棉纤维是纺织工业的重要原料之一。
研究陆地棉Aux/IAA家族基因的克隆和表达特征，可以为研究棉花生长发育提供重要参考。
二、研究目的本研究旨在克隆陆地棉Aux/IAA家族九个基因，并分析其在不同组织和发育阶段中的表达特征，为进一步研究棉花生长发育提供理论依据。
三、研究内容和方法1. 克隆陆地棉Aux/IAA家族九个基因本研究将通过PCR扩增的方式从陆地棉中克隆出九个Aux/IAA家族基因的全长序列，并进行测序验证。
2. 利用qRT-PCR分析陆地棉Aux/IAA家族基因表达特征本研究将使用qRT-PCR技术，分析陆地棉Aux/IAA家族基因在花药、花瓣、苞叶、枝条等不同组织和不同发育阶段 (包括开花前、开花中、开花后) 中的表达特征。
四、预期结果本研究将成功克隆出陆地棉Aux/IAA家族九个基因的全长序列，同时分析了这些基因在不同组织和发育阶段中的表达特征。
通过该研究，可以揭示陆地棉生长发育中Aux/IAA家族基因的表达规律，为棉花遗传育种、生长发育调控等提供重要参考。
五、研究意义本研究将对陆地棉基因组学研究和生长发育调控的探索具有重要意义。
同时，该研究的成果还将为棉花生产和遗传育种的实践提供科学依据，具有一定的实际应用价值。
基因克隆的基本原理的应用
基因克隆的基本原理及应用1. 前言基因克隆是分子生物学中的一个重要技术，通过将DNA片段从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中，实现对基因的表达和功能的研究。
本文将介绍基因克隆的基本原理和其在生物科学研究、医学领域以及农业领域的应用。
2. 基因克隆的基本原理基因克隆的基本原理包括以下几个步骤：2.1 DNA提取首先，需要从捐献者的细胞中提取DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐析法和商业化试剂盒法等。
2.2 DNA片段制备通过限制性内切酶对DNA进行切割，得到所需要的DNA片段。
限制性内切酶是一种特异性切割DNA的酶，能够在特定的DNA序列上切割。
2.3 载体准备选择适当的载体（如质粒或病毒），并将其进行准备。
质粒是一种环状的DNA 分子，具有自主复制的能力，并能被基因工程操作所改变。
2.4 核酸连接将DNA片段与载体进行连接，通常采用DNA连接酶将两者连接起来形成重组DNA。
2.5 转化将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是指将外源DNA导入宿主细胞，在宿主细胞中复制和表达。
2.6 筛选经过转化后，使用适当的选择标记（如抗生素抗性基因）、检测方法或者荧光蛋白的表达等筛选方法，选出含有目标基因的克隆。
3. 基因克隆的应用基因克隆技术在生物科学研究、医学领域以及农业领域有广泛的应用。
3.1 生物科学研究基因克隆技术为生物科学研究提供了强有力的工具。
通过对特定基因的克隆与表达，可以研究该基因在细胞过程、生物发育和疾病发生中的功能和调控机制。
例如，研究人类基因在小鼠模型中的功能，有助于揭示人类遗传性疾病的发病机制。
3.2 医学领域基因克隆在医学领域具有重要的应用价值。
通过克隆人类基因，可以制备重组蛋白或基因药物，用于治疗疾病。
此外，基因克隆技术还可以用于基因诊断、疫苗制备以及基因治疗等领域。
3.3 农业领域基因克隆技术在农业领域的应用主要包括转基因作物的培育。
通过将特定基因导入植物，可以使植物获得抗虫害、抗逆境、提高产量等性状，从而提高农作物的品质和产量。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达
Ｃ ｉｅｅＪ ｕｎ ｌ ｆＶｅｅｉａｙＭｅ ｉｎ ｈｎ ｓ ｏ ｒａ ｏ ｔｒｎｒ ｄｃ ｅ ｉ
中 国兽 医 杂 志 ２ ０ ０ ７年 （ ４ 卷 ） １ 第 ３ 第 Ｏ期
３
猪 繁殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 非 结 构 蛋 白 Ｎｐ ｓ ９基 因 的克 隆 与 原 核 表 达
沈 张 奇 ，郭 鑫 ，杨 汉春 ， 新 娜 ，陈艳 红 ，查振 林 盖
（ 国农 业 大学 农 业 部 预 防 兽 医 学 重 点 开 放 实 验 室 ， 京 海 淀 １ ０ ９ ） 中 北 ０ ０ ４
摘 要 ： 过 Ｐ Ｒ方 法 从 重 组 质 粒 ｐ Ｋ Ｂ 通 Ｃ Ｓ — ２扩增 得 到 非 结 构 蛋 白 Ｎｓ９的 基 因片 段 。将 基 因克 隆 至 原 核 表 达 载 体 ｐ Ｔ ２ ａ ｐ Ｅ 一８
关 键 词 ： 繁 殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 ； 结 构 蛋 白 ；Ｎｓ９基 因 ； 隆 ；原 核 表 达 猪 非 ｐ 克 中 图分 类 号 ： ８ Ｑ７ ６ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：５９６ ０ （０ ７ １～０ ３０ ０ ２—０ ５２ ０ ） ００ ０ —３
Ｃｌ ｎ ｎ ｎ ｏ ｒ ｏ ｉ ｘ ｅ ｓｏ ｆｎｏ — ｔ ｕ ｔ ｒ ｌｐｒ ｔ ｉ ｐ９ ｇ ｎ ｏ ｉ ｇ ａ ｄ ｐｒ ｋａ ｙ ｔｃ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｎ ｓ ｒ ｃ ｕ ａ ｏ ｅ ｎ Ｎｓ ｅ ｅ ｏ ｒ ｉ ｅ Ｒｅ ｒ ｄ ｃ ｉ ｅ ａ ｓ ｒ ｔ ｒ ｙ ｒ ｍ ｅ Ｖｉ ｕ ｆ Ｐｏ ｃ ｎ ｐ ｏ ｕ ｔｖ ｎｄ Ｒｅ ｐｉ ａ ｏ ｙ Ｓ ｎｄ ｏ ｒ ｓ
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《甜瓜果实发育相关四个基因家族的全基因组分析及CmERF11-9基因的功能研究》范文
《甜瓜果实发育相关四个基因家族的全基因组分析及CmERF11-9基因的功能研究》篇一一、引言甜瓜作为世界各地广泛种植的水果之一，其果实发育过程涉及到多个基因家族的共同作用。
近年来，随着全基因组测序技术的发展，对甜瓜果实发育相关基因家族的研究日益深入。
本文旨在分析四个与甜瓜果实发育密切相关的基因家族，并针对其中CmERF11-9基因进行功能研究，以期为甜瓜育种和果实品质改良提供理论依据。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料为甜瓜（Cucumis melo L.）的基因组数据及果实发育过程中的相关样本。
2.2 方法（1）全基因组分析：利用生物信息学方法，对四个与甜瓜果实发育相关的基因家族进行全基因组扫描，分析其基因结构、表达模式及调控网络。
（2）CmERF11-9基因的克隆与表达分析：通过PCR技术克隆CmERF11-9基因，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析其在不同果实发育阶段的表达情况。
（3）CmERF11-9基因功能研究：利用分子生物学技术，通过转基因等方法研究CmERF11-9基因在甜瓜果实发育中的功能。
三、全基因组分析结果通过对四个与甜瓜果实发育相关的基因家族进行全基因组分析，我们发现这些基因家族在甜瓜果实发育过程中具有重要功能。
其中，某些基因参与了果实的糖分代谢、细胞分裂与扩张、以及果实品质的形成等过程。
此外，我们还发现这些基因家族的表达受到多种环境因素和内源激素的调控。
四、CmERF11-9基因的克隆与表达分析通过PCR技术成功克隆了CmERF11-9基因，并利用qRT-PCR技术分析了其在不同果实发育阶段的表达情况。
结果显示，CmERF11-9基因在甜瓜果实发育过程中表达量呈现动态变化，尤其在果实成熟期表达量达到高峰。
这表明CmERF11-9基因可能参与了甜瓜果实的成熟过程。
五、CmERF11-9基因功能研究通过转基因等方法，我们研究了CmERF11-9基因在甜瓜果实发育中的功能。
《基因克隆与表达》课件
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
基因克隆与表达
精选2021版课件
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAG精E选2021版课件
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影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
精选2021版课件
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1、连接
连接、转化与重组子鉴定
精选2021版课件
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（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
精选2021版课件
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2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度 不高，连接缓冲液宜分装；
单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
精选2021版课件
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抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
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电 泳 方 向
精选2021版课件
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凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
精选2021版课件
基因克隆与表达的研究方法
基因克隆与表达的研究方法基因克隆和表达是生命科学中重要的研究方法，它们在基因工程、药物研发、癌症治疗等领域发挥着重要作用。
在克隆和表达一个基因之前，需要先建立一个可重复的实验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍基因克隆和表达的一些通用方法和技术。
1. PCR扩增PCR扩增是一种常用的克隆方法，它可以在短时间内高效地扩增DNA序列。
这种方法需要一对引物，在PCR反应中引物定向扩增目标序列。
PCR反应需要一个DNA模板、引物和聚合酶，在合适的反应条件和温度下进行。
PCR扩增后的产物可以纯化、酶切、克隆到表达载体上。
2. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化是一种分子生物学技术，可以将DNA分子切成不同的长度，并生成暴露的粘性末端。
这样的末端可以与其他的DNA分子的互补末端连接起来，从而实现DNA的克隆。
在DNA克隆中，选择合适的限制性内切酶可以实现目标DNA序列的克隆。
3. 匀浆凝胶电泳匀浆凝胶电泳是一种检测DNA大小的技术，它可以用于确认PCR扩增产物的大小，鉴定DNA克隆的有效性以及纯化DNA等。
在匀浆凝胶电泳中，DNA样品被负载到凝胶上，并在电场作用下迁移。
根据DNA分子大小的不同，可以通过在凝胶上形成特定的DNA带和条带，从而检测DNA分子的大小。
4. 蛋白表达的研究方法蛋白表达是生命科学研究中重要的实验方法，可以获得对生命过程和重要分子的深入了解。
在蛋白表达中，需要克隆一个给定的基因到一个特定的表达载体上。
表达载体中包含能够转录和翻译蛋白质所需的所有元件。
在表达系统中，可以使用细胞培养、原核生物、真核生物等不同的宿主来表达蛋白。
5. 功能分析的研究方法在获得基因克隆和表达蛋白之后，需要通过功能分析进一步了解目标基因和蛋白的生物学功能。
在功能分析中，常用的方法包括基因敲除、蛋白互作、基因组学、蛋白质修饰等。
通过这些方法，可以深入研究生物学体系的信号传导、调节机制、发育和疾病机制等问题。
植物光合作用相关基因的克隆与表达
植物光合作用相关基因的克隆与表达植物光合作用是指在光的作用下，植物体内的叶绿素吸收光能，将其转化成化学能，从而产生能量和氧气的过程。
植物光合作用是生命的基础能量来源之一，也是维持生态系统平衡的重要过程。
植物光合作用的相关基因克隆和表达，是近年来植物学研究的热点之一。
这一研究方向主要集中在植物光合作用的细胞生物学、分子生物学和基因组学等方面。
细胞生物学角度，植物体内的光合细胞有两种类型：一种是负责光合作用的叶绿体细胞，另一种是负责运输产物的质体细胞。
这两种细胞在外形和功能上有所不同，其内部的基因表达和调控也存在差异。
因此，研究植物光合作用相关基因的克隆和表达，需要从细胞类型的角度进行分析。
分子生物学角度，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，主要探索基因的结构、功能和调控等方面。
例如，利用PCR技术和基因克隆技术，可以获得植物体内的光合作用相关基因，然后通过生物信息学工具对基因序列、编码蛋白质和表达谱进行分析。
另外，还可以应用转基因技术构建基因敲除或添加的重组植物株系，进一步揭示光合作用相关基因在植物体内的作用和机理。
基因组学角度，随着高通量测序技术的发展和基因组数据的丰富，研究人员可以在全局范围内分析植物光合作用相关基因的基因组学特征、进化关系和功能注释。
例如，通过对一些重要植物基因的全基因组序列比较，可以发现在多个物种中保守的部位和变异的部位，进而获得这些基因在植物演化中的起源和分化过程。
此外，研究人员也可以利用系统生物学的方法，将各个基因的作用和调控网络进行拼凑和模拟，从而模拟出更加细致的植物光合作用模型。
总之，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，对于理解植物生物学和解决环境保护和农业生产中的问题，具有重要意义。
希望未来能够有更多的研究成果和创新突破。
基因克隆与表达
基因表达的检测方法
Northern blot：检测mRNA的方法，可用于检测基因的表达水平。
RT-PCR：通过逆转录和PCR技术，检测特定基因的表达水平。
Western blot：检测蛋白质的方法，可用于检测基因的表达产物。 免疫荧光技术：通过抗体与目标蛋白质的结合，利用荧光标记技术进行 检测。
基因克隆与表达的研究流程
同的后代。
克隆技术可以用 于繁殖动物、植 物和微生物，以 及用于生产转基 因生物和基因治
疗。
克隆技术的主要 步骤包括获取供 体细胞的DNA、 将DNA植入受 体细胞、培养产 生的胚胎并使其 发育成新个体。
克隆技术的优点 包括可以快速繁 殖具有优良性状 的动物和植物， 以及可以用于基 因治疗和药物生
产等领域。
生物安全：基因 克隆与表达技术 可用于检测和预 防生物威胁，如 生物武器和病原 体的传播，保障 公共安全。
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克隆技术的应用：克隆技术在医学、农业、生物技术等领域具有广泛的应用价值，例如 用于生产转基因动物、研究动物模型、繁殖濒危物种等。
克隆技术的分类
胚胎干细胞克隆技术 核移植克隆技术 转基因克隆技术 基因克隆技术
克隆技术的应用
添加项标题
克隆动物：通过基因克隆技术可以繁殖出具有相同基因的动物， 用于医学研究、药物筛选和动物模型建立等。
03 基因表达的调控
基因表达的概述
基因表达的定义：基因表达是指基因经过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质的过程。
基因表达的调控方式：包括转录水平的调控、转录后的调控和翻译水平的调控。
基因表达的调控机制：包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。
基因表达的生物学意义：基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢和环境适应性等方 面具有重要意义。目的基因的获取：通过基因、PCR、基因合成等方法获取目的基因
基因工程中的基因克隆与表达
基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。
其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。
本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。
一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。
基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。
通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。
2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。
限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。
该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。
这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。
PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。
PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。
TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。
该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。
基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。
基因文库分为cDNA文库和基因组文库。
通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。
3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。
例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。
二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。
海洋噬菌体EJ(3)9P1 ORF172基因的克隆与表达
Ｃｌ ｎ ｎ ｎ ｐ ｅ ｓｏ ｆ ＯＲＦ１ ２ Ｇ ｅ ｅ ｏ ｉ ｇ ａ ｄ Ｅｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ７ ｎ
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噬菌 体是 海洋 环境 中最 丰富 的生 物体种 类 之一 ， 多样 性 极 其 丰富 ¨ 。 目前 已经 或 正 在 被测 序 的海 ］ 洋 噬菌体 大约有 几 十个 Ｉ ， ４ 与海 洋 噬菌体 的庞 大数 量相 比微 不足 道 。Ｅ （ ） Ｐ 是 我们 实 验室 自行 分 Ｊ３ ９ １
海 洋噬 菌体 Ｅ （ ） Ｐ Ｒ １２基 因 Ｊ ３ ９ １Ｏ Ｆ ７ 的 克 隆 与 表 达
董 浩 ， 云灿 艾
（ ． 山 大学 生 命 科 学 院 ， 害生 物 控 制 与 资 源利 用 国 家 重 点 实 验 室 ， 东 广 州 ５ ０ ７ ；２ 吉 林 农 业 大 学 生 命 １中 有 广 １２５ ． 科学学 院， 吉林 长 春 １０ １ ） ３ １８
Ｌｆ， ｉｎＡ ｒ ｕｔｒ ｎｖｒ ｔ；Ｃ ａ ｇｈ ｎ１ ０ ， ｈ ａ ｉ Ｊ ｉ ｇｉ ｌ ｅＵ ｉ ｓ ｙ ｈｎ ｃ ｕ ３ Ｃ ｉ ） ｅ ｌ ｃ ｕ ｅｉ １８ １ ｎ
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• PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端 多加一个A
三. 重组基因导入细胞
在基因克隆技术中，将质粒 DNA 及其重组体 导入细菌称为转化( transformation )；病毒及其重组 体导入受体细胞称为转染( transfection )；噬菌体及
其重组体导入受体细胞称转导( transduction )。
• 9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、 20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤 离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分 钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机 相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反 应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉 淀核酸，并且无需洗盐。） 10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。 室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风 干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻 弹管底数次，将液体分散挂在管壁上， DNA 的所有片段随机地连接到载体上，然 后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖构成 各 DNA 片段的克隆，当制备的克隆数目多到可以
把某种生物的全部遗传信息都包含在内的情况下，
这一组克隆的总体就被称为该种生物的基因。 因此，目的基因可以从基因中筛选获得。
基因克隆的基本程序
一. 分离或合成外源基因
1. 直接从染色体 DNA 中分离
一些 DNA物理图谱已经确定，背景资料比较清 楚的原核生物，可以采用直接分离法分离制备目的基 因。从原核生物中提取纯化DNA 之后，根据它的限 制性核酸内切酶物理图谱进行基因定位，便能很方便 地从该 DNA限制性核酸内切酶消化片段的电泳凝胶 上回收目的基因。但是，对于真核生物 DNA 分子大， 染色体数目多，采用直接法制备目的基因比较困难。
转染细菌，可产生103-4个噬菌斑；如用体外包装的具
感染力的λ噬菌体颗粒，每微克可产生106个噬菌斑，
比不包装裸露的重组λ DNA 效率增加100倍。
4. 受体细胞的选择
受体细胞是重组基因增殖的场所。对受体细胞
也应具有几个要求： ①容易接纳重组分子； ②对
载体的复制扩增无严格限制； ③不存在特异的内
LB + MgSO4 LB
Charon
EMBL3 λgt10
LE392 C600
LE392 C600 hflA
LB + MgSO4
LB + MgSO4 LB + MgSO4
pGEM
λ gt11
JM105 JM109
Y1090 BNN97
LB/Ap
LB/Ap + MgSO4
四. 重组体的筛选与鉴定
1. 抗生素平板等筛选
填平
CGA-3’ T-5’
填平
5’-GGATC 3’-CCTAG
受体
CGA-3’ GCT-5’
供体
5’-GGATCCGA-3’ 3’-CCTAGGCT-5’ BamH Ⅰ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ BamH Ⅰ 5’-G 3’-CCTAG
填平末端
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bgl Ⅱ GATCT-3A 抽提出来，再通过逆 不包括内含子和其它不表达 的 DNA 序列。
２. 从 mRNA 合成 cDNA
目的基因可以通过纯化的 mRNA 经逆转录合成 获得。例如网织细胞合成的蛋白质，90%是血红蛋白 ( Hb) 的α、β链。用抗Hb的抗体与网织细胞中分离出
来的多聚核糖体一起保温，使多聚核糖体沉淀出来，
再从其中可分离到Hb的mRNA。纯化mRNA的在逆
转录酶催化下可以得到Hb的cDNA 。
利用载体的表型特征或遗传标记直接筛选。如：
质粒、粘粒具有抗药性标记，它们转化宿主细胞后，
都能在含有抗菌素 (Amp或Tet)的培养板上生长；而
未转化的宿主细胞则不能生长。这样可从大量的细
胞群体中筛选出转化子与非转化子。对于噬菌体来 说，噬菌斑的形成就是他们自我选择的特征。对于 重组子与非重组子的筛选则用:
酶切
5’-GAATT 3’-CTTAA
受体
CC-3’ GG-5’
供体
5’-GAATTCC-3’ 3’-CTTAAGG-5’ EcoR Ⅰ
BamH Ⅰ 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
酶切
Taq Ⅰ(或Cla Ⅰ) 5’-TCGA-3’ 3’-AGCT-5’
酶切
5’-G 3’-CCTAG
二
.
目 的 基 因 与 载 体 重 组
1
.
粘⑴ 性同 末源 端互 连补 接粘
性 末 端 连 接
⑵ 非 同 源 互 补 粘 性 末 端 连 接
(
定 向 克 隆 ）
2. 平端连接
EcoR Ⅰ 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
酶切
Hae Ⅲ
5’-G 3’-CTTAA
填平
5’-GGCC-3’ 3’-CCGG-5’
• （提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在 10U/μL左右，3μL内切酶相当于30U，足够切 10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－ 600ng/μL，一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶 切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）
• 2.1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法 ) • 1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用 1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。 2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断 （插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦 拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒， 而后切胶回收。） 3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20 分钟。 4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端， 两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径 3mm左右的平头，准备用于碎胶。
• 九.基因的克隆与表达
• 基因的克隆 • 基因的表达
基因克隆（分子克隆molecular cloning） ----通过体外重组技术,将一段目的DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受 体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。
基因克隆的技术路线 目的基因 载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA
1. 氯化钙转化法
2. 电击转化法
电击法不需要预先诱导细菌进入感受态，只
依靠短暂的电击，促进 DNA 进入细胞。因其操
作简单方便、转化率亦高，愈来愈为人们接受。
3. 体外包装转染法
利用噬菌体颗粒能够将自身DNA 有效地注入到 寄生菌细胞内的原理，将λ噬菌体头部及尾部蛋白与 λ DNA 重组体混合，组装成完整的噬菌体颗粒，再 来感染大肠杆菌。研究发现每微克重组λ DNA 直接
• 5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平 头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮， 不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时 就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶） 6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。 7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。 8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇 （24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖 紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
5. 人工合成基因
一些简单的多肽（如生长抑制素，含14个氨基 酸），可以在已知其一级结构的基础上，按这些 氨基酸编码的核苷酸系列来合成基因。
6. PCR扩增目的基因从中分离目的基因虽然有效，但都存在步骤多、费时、
筛选工作量大等困难，而且更为重要的问题是往往不能获 得完整的全长基因。PCR 技术可根据研究目的不同，既可
的质粒转化细胞及未转化细胞是不能生长的。
⑶ β-半乳糖苷酶显色反应 pUC 系列、pEGM 系列、M13 中引入了编码 LacZ 基因的α肽顺序，其中含有多克隆酶切位点。当无外 源基因片段插入时，质粒表达α肽，它与宿主菌编码 N-末端α-多肽缺陷的β-半乳糖苷酶多肽发生基因互补， 形成有活性的β-半乳糖苷酶，在含有底物 X-gal 和诱 导剂 IPTG 的存在下，菌落呈蓝色；如果LacZ 基因 中插入外源基因，造成插入失活，使之不能产生α多 肽，转化细胞失去了α-互补，将无β-半乳糖苷酶活性 存在，因此在X-gal 平板上，阳性重组子为白色菌落。
选择以 DNA 为模板，通过扩增后得到含内含子和调控顺序
在内的完整基因；又可选择以 RNA 为起始材料，经逆转录 成 cDNA，扩增后得到无内含子，无调控顺序，只有结构
基因的核酸片段。通过 PCR 扩增可获得目的 DNA或其中
某一特定顺序隆中 DNA 操作变 得更为快捷和准确。
切酶体系降解外源 DNA； ④不对外源 DNA 进行
修饰； ⑤符合“重组 DNA 操作规则”安全标准。
常用载体所用的宿主细胞
载体
pBR322
宿主细胞
LE392 HB101 JM107 JM109
培养基
LB/ 抗菌素
pUC系列
λ噬菌体 M13
JM103
LE392 JM103 JM107 JM109
LB/Ap
填平末端
5’-GGATC 3’-CCTAG
连接
GATCT-3’ CTAGA-5’ 5’-GGATCGATCT-3’ 3’-CCTAGCTAGA-5’ Cla Ⅰ
3、T-A克隆
• pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用 载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位 点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用 EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添基因的序列分析