花色素结构假说

1材料与方法
1.1材料
供试南果梨采自辽宁省海城市接文镇宋家堡村10～12年生南果梨树，于2012年8月25日种子褐色期按果树正南方向，中部同等高度取果实10个，试验设3次重复。
供试盐酸、95%乙醇、氯化钾、无水乙酸钠均为分析纯，由沈阳化学试剂厂生产；供试D101大孔树脂为国药集团化学试剂有限公司生产；供试甲醇、甲酸均为色谱纯，为国药集团化学试剂有限公司生产。试验采用的仪器有：N-1001型旋转蒸发仪、SHB-Ⅲ循环水式真空泵、DHL-A型电脑恒流泵、Christ真空冷冻干燥机和1100液质联用仪。
花色素结构假说
田晓艳
沈阳农业大学**********************
摘要：本研究对南果梨果皮花色素进行了质谱分析，经过对一级质谱和二级质谱的详细推算，认为自然界的花色素是以钟罩体或灯笼体或小球体形式存在，要么由单纯花色素单元组成，要么与葡萄糖连接而成。钟罩体或灯笼体，连接在细胞膜和叶绿体膜之间或叶绿体双层膜之间；小球体连接在叶绿体双层膜之间或叶绿体与基粒膜之间或基粒膜之间，有特定分子量和形状，及特定的空间构型。以往人们提出的六种花色素，天竺葵色素，矢车菊色素，飞燕草色素，芍药色素，矮牵牛色素，锦葵色素，既存在也不存在，因为在自然界状态下，不存在这些花色素单体，它们只不过是花色素钟罩体或灯笼体或小球体水解时得到的不同片段。花色素主要是苯基苯并吡喃通过氧桥连接而成的类似钟罩的网状大分子或灯笼体或小球体。B环上的3′、5′位通过氧桥，手拉手般相连在一起，酸解后，就会得到人们以往所提出的矢车菊色素或飞燕草色素；B环若没有氧桥相连，酸解后得到的就是天竺葵色素；钟罩体或灯笼体或小球体的顶端起始有3种形式，葡萄糖分子或甲氧苯基苯并吡喃或乙氧苯基苯并吡喃与细胞膜或叶绿体膜或基粒膜上的磷脂双分子层的磷酸羟基相连，钟罩体底端通过苯并吡喃环上的5-C位与叶绿体膜或叶绿体基粒膜上的磷脂以氧桥相连；灯笼体或小球体的底端通过甲氧基或乙氧基与叶绿体膜或叶绿体基粒膜上的磷脂以氧桥相连。钟罩体或灯笼体或小球体两顶端若是通过B环上3′或5′位一个甲氧基将苯基苯并吡喃与细胞膜相连，酸水解后，就得到人们所说的芍药色素；顶端若是通过B环上3′、5′位两个甲氧基将苯基苯并吡喃环与细胞膜相连，酸水解后，就得到人们所说的锦葵色素或矮牵牛色素。因此，花色素酸水解后，人们以往提出的天竺葵色素，矢车菊色素，飞燕草色素含量高，而芍药色素，矮牵牛色素，锦葵色素含量低与本研究假说是吻合的，因为人们理念中的芍药色素、矮牵牛色素、锦葵色素仅仅存在于顶端。不同的花和果实之所以呈现不同颜色，关键在于花色素钟罩体或灯笼体或小球体的密集度以及氧桥的丰度，钟罩体或灯笼体或小球体的密集度以及氧桥的丰度越高，则蓝移；越低，则红移。花色素主要功能是防止紫外线对果实或花朵的伤害，就像一层天网罩在叶绿体膜或基粒膜上，紫外光高能光子通过花色素大分子时，激活的高能电子在通过花色素众多p-π共轭环时，环内电子高速旋转，摩擦产生热能释放出去，同时高能电子变为低能电子传递给叶绿体，从而保证了叶绿体能够正常进行光合作用。
本研究认为二级质谱的某一段峰或相对直线部分所表达的都是相同的某一个色素大分子的所有片段，换言之，就是没有片段丢失，所有片段的和就是一个完整的花色素网状大分子或小球体或灯笼体。
本研究依据这样的指导思想，结合一级图谱和二级图谱，认为该南果梨果皮样品含有61种花色素分子。峰与峰之间或许还容易区分，那么相对直线部分，又是如何彼此划分开呢？本着中国《易经》数生相，相有形，形有体的原则，认为数变则相变，相变则体变。结合一级图谱的+MS图谱和二级图谱的+MS2图谱的数变，确定每种花色素分子的起始，从而确定了全部花色素分子。
苯环直径为0.58nm，一个花色素单元直径视为0.58*2=1.16nm。植物细胞大小10-100μm，叶绿体直径4-10μm，叶绿体外膜和内膜合称被膜，每层膜厚度6-8nm，内外层膜间隙在10-20nm。
基于以上的假说，本研究对该样品的61种花色素的分子大小，结构及在细胞中所处的位置及与膜的连接方式，进行详细论述。
本研究认为，在花色素大分子形成过程中，存在一种加氧酶以氧桥方式直接将各个花色素单元连接在一起的，不是花色素单元上先有-OH，再互相脱水以O相连。这里仅仅是为了计算方便，便于理解，才利用人们惯用的天竺葵，矢车菊，飞燕草等概念及分子量进行计算分析。天竺葵的概念是提供4个-OH，矢车菊的概念是提供5个-OH，飞燕草的概念是提供6个-OH参加脱水反应，我们这里所说的脱水反应只是方便之说。
我要表达的思想是：花色素大分子是特殊的自身带氧正离子的生物大分子，它的一级质谱，只要是控制好质谱条件，就能得到完整的分子图谱，即使它们中有部分化学键断裂，某片段即使象旗帜一样飘扬着，但依然连接在完整的大分子内。虽然测到不同的核质比，是因为大分子自身电荷数发生变化所致。
2.3南果梨果实花色素二级质谱分析假说详解
花色素大分子，一层B环，相当于4个苯环；一层苯并吡喃，相当于8个苯环。电子流在层层间传递过程中，就好比水流一样，4个苯环汇聚，8个苯环扩散，在汇聚过程中，电子流加速，在扩散过程中电子流减速，电能降低，释放热能。这样不断的汇聚扩散，即保持了电子流的速度，又降低了电能，保证电子流以低能状态顺利到达叶绿体进行光合作用。若没有汇聚作用，电子流速度过低，不能保证电能的快速传递。这样的空间构型保证了为叶绿体获得低能电子流的效率。
我要阐明的意思是：对于本研究，能进入二级质谱的是花色素完整的大分子，虽然它可能局部化学键断裂，但依然保持整体性，而不是碎裂的片段。
图5 33.5-33.6min峰+MS2图谱
以33.5-33.6min峰+MS2图谱为例，图5为该花色素分子完整+MS2图谱，离子峰值分别为398.8，399.3，367.3，351.5。398.8片段级别是×104、399.3片段级别是×104、367.3片段级别是×103、351.5片段级别是×106；本研究认为它们是一个整体的4个片段，都应该在×106级别上，之所以有减少，是因为不同的片段有再次环化过程，其生成机率及被监测到的机率不wk.baidu.com；若碎片没来得及环化，以带负电荷形式存在而不能被检测到。
每种花色素分子，不论是网状钟罩式或小球体或灯笼体，都有顶，要么是苯基苯并吡喃做顶，要么是葡萄糖做顶，先合成第一层B环，4个B环以4′位与作为顶的苯基苯并吡喃或葡萄糖以氧桥相连，同时4个B环3′、5′位以4个氧桥手拉手式相连，或者不相连或者某两个B环两两相连，氧桥的多寡取决于当时葡萄糖的含量及氧桥酶的活性，本研究认为，花色素的生物合成主要底物是葡萄糖和乙酰辅酶A。葡萄糖含量高，氧桥的丰度就高。当然也取决于该物种的氧桥酶活性。第二层合成含有A环的苯并吡喃，第三层再合成B环，第四层再合成有A环的苯并吡喃，以此重复下去，生成的层数取决于细胞膜与叶绿体膜之间的距离，或叶绿体双层膜间距及叶绿体膜与基粒膜间距。因为花色素分子的主要功能就是保护叶绿体膜或基粒膜免受紫外光伤害并且利用紫外光光能，保证光合作用顺利进行。花色素分子就好比中国神话中的女娲补天中的七彩石，花色素分子是花或果实的七彩补天网。提出这个假说的前提就是大道至简，因为真正的大道，简单的不能再简单。太阳光有红外光区域、可见光区域、紫外光区域。太阳光不会因为你是花朵或果实就额外关照你，针对你的喜好而给你提供红光或柔和的可见光，它是普照一切的。那么植物必然会接受到一切光谱。春天太阳光中紫外光含量低，树叶能进行正常的光合作用，少量的紫外光由树叶细胞质中黄酮类物质吸收并释放热能，降低了能量，再提供给叶绿体进行光合作用。植物不会浪费一丝光源的，一切光源都会被利用。到秋天，紫外光强烈，树叶变黄，实质是黄酮类有色物质增加，目的是为了减少紫外光带来的伤害并且利用紫外光光能进行光合作用。作为花或果实，是特殊的生殖器官，具有器官特异性，自身就能进行光合作用，并且具有合成花色素相关的酶，例如氧桥酶、B环合成酶、合成含有A环的苯并吡喃酶，生成花色素大分子充分利用光能，同时也具有花色艳丽，招蜂引蝶，为了更好繁殖的功效。
前言：
本研究6年多来一直针对提高南果梨花色素含量做了大量的田间和实验室工作，南果梨是中国特产，秋子梨的变种，只产于辽宁省鞍山市和海城市一带，香气怡人，口感浓郁，是梨果精品，堪称梨中之王。但南果梨致命不足就是成熟期果实遇雨褪色，果实品质急剧下降，并且再着色困难，品质一落千丈，给果农带来极大的经济损失，一年的收入很大程度取决于成熟期的光照和雨水情况。为了解决这个生产难题，本研究针对南果梨果实花色素做了质谱分析，却意外发现了花色素天然存在下的合理状态，不是人们一直以来盲人摸象的状态，它是一个完整的网状大分子或小球体，不是片段。
2.3.1南果梨果实花色素立体结构及平面示意图详解
图4二级质谱图
二级质谱相对于一级质谱，已经丢失了很多花色素分子了。例如33.5-33.6峰值，一级质谱总离子图谱大概在1.2×108级别上；而二级质谱总离子图谱已经是×106级别了；损失了一百倍的花色素分子，它们哪里去了呢？它们被打碎了，几乎都以带正电荷的片段被检测器扑捉而不会进入二级质谱了。
1.2.2南果梨花色苷的HPLC-DAD-ESI-MS鉴定色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18(2.1mm×150mm，3.0 µm)；流动相的A液为甲醇，B液为0.5%甲酸水；线性梯度洗脱顺序为0～15min，A液15%～40%；15～30min，A液40%～90%；30～35min，90%～90%；进样量为5µL；柱温为30℃；流速为0.2mL.min-1；DAD检测器的检测波长为530nm。
1.2方法
1.2.1南果梨花色苷的提取及纯化取种子褐色期南果梨果实的果皮10g，充分研磨后，加入250mL1%盐酸乙醇溶液，放于50℃恒温水浴锅4h，4000r.min-1离心10min，滤渣按相同提取方法再次提取，至滤液为无色，合并滤液并定容到相同体积，采用pH示差法测定花色苷含量[9]。
粗提液减压浓缩后，经预处理的D101大孔吸附树脂纯化，用重蒸水洗脱去除糖、有机酸及蛋白质等杂质，后用60%乙醇洗脱，收集花色苷洗脱液，真空浓缩，冷冻干燥至深红色粉末，备用。
质谱条件:正离子扫描（ESI+，M/Z 50～1000）；击碎电压（CE）为1.0V；气帘气为Nebalizer 30psi；Drygas为6.0L.min-1；Drytemp为320℃。
2结果与分析
2.1南果梨果实花色素一级质谱和二级质谱分析的假说前提
本研究组对花色素大分子的一级质谱和二级质谱的分析，本着中国古老文明之大道至简的原则，认为一级质谱的某一段峰或相对直线部分所表达的都是相同的某一个色素大分子，因为花色素含量丰度不同，而出现峰或相对直线。相对直线部分丰度在103-105之间，峰值部分丰度在105-108之间。花色素大分子是一个特殊的大分子，花色素基本单元含有O+，在经过一级质谱分析时，因O+两侧的化学键可能发生随机断裂而使分子内重排或直接加氢后O+恢复为O2-，从而导致花色素分子所含有的电荷数发生变化。而化学键断裂的方式或加氢方式取决于花色素分子的大小，氧桥的多寡，从而产生不同的一级质谱+MS图谱。一级质谱断裂方式，直接决定了进入二级质谱后，形成的片段大小。质谱分析，展现的是核质比，本研究认为，对于花色素大分子而言，作为被除数的分子质量变化极微，而作为除数的核数变化，直接导致核质比发生很大变化。这也是相同的千万个花色素分子进入一级质谱分析时，可能会生成不同一级质谱+MS图谱的原因。
2.2南果梨果实花色素一级质谱分析假说详解
图1一级质谱图
图2随机抽取的16.9-18.1min峰+MS图谱
以16.9-18.1min峰为例，一级质谱峰值主要是212.9。一级质谱是分子质谱，本研究认为，一级质谱+MS图谱从16.9min#1594到18.1min#1711，每一个+MS图谱都代表若干个相似的完整的色素大分子，例如17.8min#1680，代表有丰度为106级多的色素大分子。该峰代表了花色素大分子的特殊结构，核质比稳定在212.9。
图3随机抽取的21.0-21.8min峰+MS图谱
以21.0-21.8min峰为例，一级质谱峰值主要为382.9、395、464.9。21.0-21.7min以382.9或383为主，21.7-21.8min以395、464.9为主。该峰代表了花色素大分子因电荷数变化导致核质比变化，是该花色素特殊结构决定的。