基于高通量测序的分子育种研究
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表型 分子标记开发 基因型
选择 育种
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研究背景
传统的分子标记（SSR，RFLP等）密度较低，很难实现对 功能基因的精细定位，高通量技术正好弥补了这一缺憾。
传统基因分型技术 标记类型 技术手段 标记密度 项目周期 AFLP，RFLP，SSR等 电泳分型 几十个到几百个不等 半年以上 高通量基因分型 SNP/InDel等 高通量测序 生物信息分析 几千到几十万个不等 约4个月
基因精细 定位
分子育种
新基因挖 掘
种质资源 分子遗传 评估 分子标记 辅助选择 分子标记 遗传效应 剖分
基因表达 调控
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研究背景 研究策略 案例解析
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研究背景 研究策略 案例解析
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案例解析
分析方向
Ø 突变体 Ø 作图群体 Ø 自然群体
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研究背景
育种现状
随着高通量技术的成熟， 基因组计划顺利进行和分 子生物学技术的迅速发展 术平台促进了育种研究应 用开始进入分子水平
新基因聚 合育种 品种分子 设计 优良性状 遗传基础
•
•
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10/9/1328
案例解析-作图群体
P1 根据性状选择亲本 构建性状分离群体 RIL 全基因组重测序 简化基因组测序 P2 F1
基因分型
性状统计
连锁分析 主效QTL位点
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作图群体
案例解析-作图群体
1、混合分组分析（BSA）
混合分组分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）:又称分离体分组 混合分析法或集团分离分析法。将目标性状在F2或 RILs中表型极端的高、 低两组个体的DNA分别混合成两个 DNA 池，然后利用分子标记在两池 中进行标记与性状间的共分离分析，检测QTL。
研究背景
研究策略
科研及应用
全基因组de novo测序 全基因组重测序 简化基因组测序 泛基因组构建
基因组精细图谱绘制 种群遗传进化研究 遗传分子育种 探索疾病致病机制 ……
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研究背景
• Economically important traits: A result of artificial selection
案例解析-突变体
突变体：是某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突 变的生物体材料。
背景变异
点突变 来源
传代过程中的变异
诱导性突变
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案例解析-突变体
1、突变体及其野生对照研究方案
野生型 突变型
材料选择: 野生型与突变型遗传背景一致 测序策略： 野生型和突变型各10-20株，测 序深度不低于10。
l 基因组捕获区域小（低于 10%） l 目标性不强
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研究策略
• 不同测序深度的SNP分析
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研究策略
• Validation of variations
研究背景
分子育种是首先找到控制优良性状的基因，然后通过对优良 基因的选择从而间接实现了对优良性状的选择。 两个阶段：
1. 研究阶段：搜集大量材料的表型数据和基因型数据，通过分析找出与 控制优良性状的基因紧密连锁的分子标记（功能标记）； 2. 应用阶段：在杂交的子代中对同时具有多种功能标记的子代进行选择
研究策略
二、简化基因组测序（RAD-seq）
RAD（restriction association site DNA） 是与酶切位点相关的DNA。通过 对RAD tag的测序可以获得RAD tag上的SNP。从而进行SNPs的开发和分 型。RAD-‐seq技术在模式和非模式生物的遗传分析包括遗传图谱构建、基 因型-‐表型关联图谱、系统进化、群体遗传等研究领域具有广泛的应用前 景。
。
如果得到的候选位点过多，需要构建突变位点分离群体（与野生型回交 4-‐6代），从后代群体中只选择具有突变性状的个体进行基因分型（也可 以混合建库，分析突变群体SNP频率），最终锁定功能基因
。
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案例解析-突变体
– SNPs detect accuracy: • The best 99.9% – InDels detect accuracy (>=3bp): • In cabbage genome: >90% – SVs detect accuracy (only insertion and deletion): • >90%
• • • • SNP : SamTools/GATK InDel : SamTools/Dindel SV : Breakdance/Pindel/SOAPSV CNV : CNVnator/CNVseq
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研究策略
• 技术比较
技术 优势
l 检测方法成熟 l 遗传信息完整 l 分析方向广泛
局限性
l 需要参考序列 l 基因组较大的物种研究成 本高
全基因组重测序
RAD-seq
l 不依赖参考序列 l 价格低
变异检测 候选基因（位点）
重测序 突变体 表型性状
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功能验证
案例解析-突变体
方案延伸
如果目标性状已经进行初定位，可通过目标区域捕获，寻找变异位点
对于基因组较小的模式物种，如果目标性状已经精细定位并且野生型序列 已知，可只对突变体进行10-‐20X的重测序
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研究策略
• Genetic Variations in genome:
– Single nucleotide polymorphism (SNP) – Short insertion and deletion (InDel) – Structure variation (SV) – Copy number variation (CNV)
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基于高通量测序的分子育种 研究方案
support@novogene.cn
更多关注，敬请留意：www.novogene.cn
研究背景 研究策略 案例解析
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研究策略
全基因组重测序 简化基因组测序
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研究策略
一、全基因组重测序
Re-sequencing，即重新测序，基于全基因组重测序，能 够快速检测基因组遗传变异信息，实现遗传进化分析及 重要性状候选基因的预测。随着测序成本降低和拥有参 考基因组序列的物种增多，基因组重测序也成为育种研 究中迅速有效的方法之一，在全基因组水平扫描并检测 出与动植物重要性状相关的变异位点，具有重大的科研 价值和产业价值。
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研究背景
• 育种-发现或创造作物的遗传变异
研究物种
多样性
性状选择
选育
优良品种
常规育种, 7-15年 根据表现型选择
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基因组育种, 3-5年 根据基因选择
---ATGGCGTAGCTGAAGTCGTACGT--ATGGCGTAG---AAGTC TGGCGTAG---AAGTCGTA GGCGTAG---AAGTCG GCGTAG---AAGTCGTACG GTAG---AAGTCGTACGG TAG---AAGTCGTACGGA
ATGACGGTATGCT ACGAGAT ACGAGAT ACGAGAT ACGAGAT ACGAGAT ACGGGAT ACGAGAT
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研究策略
RAD-‐seq分析流程
A B P1
C & & P2
& & & A& &
D PCR
300,700bp
!!!! !!!!
!!!!
&
E
Index Reads
&
!!!!
!!!! !!!!
!!!! !!!!
!!!! !!!!
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研究策略
全基因组重测序应用 全基因组重测序分析流程
突变位点检测 核心种质资源品系基因组重测序 群体基因组重测序 遗传图谱构建 全基因组关联分析（GWAS） 外显子组和目标区域测序
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研究背景ຫໍສະໝຸດ Baidu
• 一个物种基因组测序计划的 完成，意味着这一物种学科 和产业发展的新开端，通过 对物种基因组序列进行系统 的研究，可以获得该物种的 基因组和重要功能基因的序 列信息，阐述该物种的进化 史，了解该物种生长发育和 适应环境的分子机制。
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2、突变体构建分离（MutMap）突变位点筛选
野生型 突变型 P1 P2
分离群体
F2
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案例解析-突变体
案例解析 MutMap快速定位水稻的突变基因
研究背景
20株突变型的水稻（F2的子代群体）混合成一个DNA池重测序（~12X/池） +野生型亲本进行重测序，通过分析子代DNA池和野生型亲本的SNP频率 差异定位和性状相关的突变区域（引起叶片浅绿突变的SNP位点）。
研究策略
• 常用分析软件
– QC
• ng-‐QC (In house) • FastQC (Open source)
– Alignment
• BWA/SOAP/MAQ • Blast/Blat
– Variations Detection
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案例解析-突变体
分析原理及研究成果
• 取样策略：野生型亲本+F2 中的20个突变型子代混合 成一个DNA池（~12X） SNP-‐index的计算方法：以 野生型亲本为参考，与参 考有差异的reads数目/总比 对上的reads数目。筛选 SNP-‐index=1的位点和引起 表型变化的SNP紧密连锁。 研究成果：1、通过 MutMap方法找到引起叶片 浅绿突变的SNP位点。2、 利用MutMap 快速找到作物 重要性状相关的突变位点： 茎长、叶长、花序数目、 花序长度、果壳长、果壳 宽度、每个花序的穗数。
选择 育种
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研究背景
传统的分子标记（SSR，RFLP等）密度较低，很难实现对 功能基因的精细定位，高通量技术正好弥补了这一缺憾。
传统基因分型技术 标记类型 技术手段 标记密度 项目周期 AFLP，RFLP，SSR等 电泳分型 几十个到几百个不等 半年以上 高通量基因分型 SNP/InDel等 高通量测序 生物信息分析 几千到几十万个不等 约4个月
基因精细 定位
分子育种
新基因挖 掘
种质资源 分子遗传 评估 分子标记 辅助选择 分子标记 遗传效应 剖分
基因表达 调控
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研究背景 研究策略 案例解析
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研究背景 研究策略 案例解析
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案例解析
分析方向
Ø 突变体 Ø 作图群体 Ø 自然群体
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研究背景
育种现状
随着高通量技术的成熟， 基因组计划顺利进行和分 子生物学技术的迅速发展 术平台促进了育种研究应 用开始进入分子水平
新基因聚 合育种 品种分子 设计 优良性状 遗传基础
•
•
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10/9/1328
案例解析-作图群体
P1 根据性状选择亲本 构建性状分离群体 RIL 全基因组重测序 简化基因组测序 P2 F1
基因分型
性状统计
连锁分析 主效QTL位点
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作图群体
案例解析-作图群体
1、混合分组分析（BSA）
混合分组分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）:又称分离体分组 混合分析法或集团分离分析法。将目标性状在F2或 RILs中表型极端的高、 低两组个体的DNA分别混合成两个 DNA 池，然后利用分子标记在两池 中进行标记与性状间的共分离分析，检测QTL。
研究背景
研究策略
科研及应用
全基因组de novo测序 全基因组重测序 简化基因组测序 泛基因组构建
基因组精细图谱绘制 种群遗传进化研究 遗传分子育种 探索疾病致病机制 ……
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研究背景
• Economically important traits: A result of artificial selection
案例解析-突变体
突变体：是某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突 变的生物体材料。
背景变异
点突变 来源
传代过程中的变异
诱导性突变
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案例解析-突变体
1、突变体及其野生对照研究方案
野生型 突变型
材料选择: 野生型与突变型遗传背景一致 测序策略： 野生型和突变型各10-20株，测 序深度不低于10。
l 基因组捕获区域小（低于 10%） l 目标性不强
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研究策略
• 不同测序深度的SNP分析
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研究策略
• Validation of variations
研究背景
分子育种是首先找到控制优良性状的基因，然后通过对优良 基因的选择从而间接实现了对优良性状的选择。 两个阶段：
1. 研究阶段：搜集大量材料的表型数据和基因型数据，通过分析找出与 控制优良性状的基因紧密连锁的分子标记（功能标记）； 2. 应用阶段：在杂交的子代中对同时具有多种功能标记的子代进行选择
研究策略
二、简化基因组测序（RAD-seq）
RAD（restriction association site DNA） 是与酶切位点相关的DNA。通过 对RAD tag的测序可以获得RAD tag上的SNP。从而进行SNPs的开发和分 型。RAD-‐seq技术在模式和非模式生物的遗传分析包括遗传图谱构建、基 因型-‐表型关联图谱、系统进化、群体遗传等研究领域具有广泛的应用前 景。
。
如果得到的候选位点过多，需要构建突变位点分离群体（与野生型回交 4-‐6代），从后代群体中只选择具有突变性状的个体进行基因分型（也可 以混合建库，分析突变群体SNP频率），最终锁定功能基因
。
Providing advanced genomic solutions!
案例解析-突变体
– SNPs detect accuracy: • The best 99.9% – InDels detect accuracy (>=3bp): • In cabbage genome: >90% – SVs detect accuracy (only insertion and deletion): • >90%
• • • • SNP : SamTools/GATK InDel : SamTools/Dindel SV : Breakdance/Pindel/SOAPSV CNV : CNVnator/CNVseq
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研究策略
• 技术比较
技术 优势
l 检测方法成熟 l 遗传信息完整 l 分析方向广泛
局限性
l 需要参考序列 l 基因组较大的物种研究成 本高
全基因组重测序
RAD-seq
l 不依赖参考序列 l 价格低
变异检测 候选基因（位点）
重测序 突变体 表型性状
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功能验证
案例解析-突变体
方案延伸
如果目标性状已经进行初定位，可通过目标区域捕获，寻找变异位点
对于基因组较小的模式物种，如果目标性状已经精细定位并且野生型序列 已知，可只对突变体进行10-‐20X的重测序
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研究策略
• Genetic Variations in genome:
– Single nucleotide polymorphism (SNP) – Short insertion and deletion (InDel) – Structure variation (SV) – Copy number variation (CNV)
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基于高通量测序的分子育种 研究方案
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研究背景 研究策略 案例解析
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研究策略
全基因组重测序 简化基因组测序
Providing advanced genomic solutions!
研究策略
一、全基因组重测序
Re-sequencing，即重新测序，基于全基因组重测序，能 够快速检测基因组遗传变异信息，实现遗传进化分析及 重要性状候选基因的预测。随着测序成本降低和拥有参 考基因组序列的物种增多，基因组重测序也成为育种研 究中迅速有效的方法之一，在全基因组水平扫描并检测 出与动植物重要性状相关的变异位点，具有重大的科研 价值和产业价值。
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研究背景
• 育种-发现或创造作物的遗传变异
研究物种
多样性
性状选择
选育
优良品种
常规育种, 7-15年 根据表现型选择
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基因组育种, 3-5年 根据基因选择
---ATGGCGTAGCTGAAGTCGTACGT--ATGGCGTAG---AAGTC TGGCGTAG---AAGTCGTA GGCGTAG---AAGTCG GCGTAG---AAGTCGTACG GTAG---AAGTCGTACGG TAG---AAGTCGTACGGA
ATGACGGTATGCT ACGAGAT ACGAGAT ACGAGAT ACGAGAT ACGAGAT ACGGGAT ACGAGAT
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研究策略
RAD-‐seq分析流程
A B P1
C & & P2
& & & A& &
D PCR
300,700bp
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E
Index Reads
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Providing advanced genomic solutions!
研究策略
全基因组重测序应用 全基因组重测序分析流程
突变位点检测 核心种质资源品系基因组重测序 群体基因组重测序 遗传图谱构建 全基因组关联分析（GWAS） 外显子组和目标区域测序
Providing advanced genomic solutions!
研究背景ຫໍສະໝຸດ Baidu
• 一个物种基因组测序计划的 完成，意味着这一物种学科 和产业发展的新开端，通过 对物种基因组序列进行系统 的研究，可以获得该物种的 基因组和重要功能基因的序 列信息，阐述该物种的进化 史，了解该物种生长发育和 适应环境的分子机制。
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2、突变体构建分离（MutMap）突变位点筛选
野生型 突变型 P1 P2
分离群体
F2
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案例解析-突变体
案例解析 MutMap快速定位水稻的突变基因
研究背景
20株突变型的水稻（F2的子代群体）混合成一个DNA池重测序（~12X/池） +野生型亲本进行重测序，通过分析子代DNA池和野生型亲本的SNP频率 差异定位和性状相关的突变区域（引起叶片浅绿突变的SNP位点）。
研究策略
• 常用分析软件
– QC
• ng-‐QC (In house) • FastQC (Open source)
– Alignment
• BWA/SOAP/MAQ • Blast/Blat
– Variations Detection
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案例解析-突变体
分析原理及研究成果
• 取样策略：野生型亲本+F2 中的20个突变型子代混合 成一个DNA池（~12X） SNP-‐index的计算方法：以 野生型亲本为参考，与参 考有差异的reads数目/总比 对上的reads数目。筛选 SNP-‐index=1的位点和引起 表型变化的SNP紧密连锁。 研究成果：1、通过 MutMap方法找到引起叶片 浅绿突变的SNP位点。2、 利用MutMap 快速找到作物 重要性状相关的突变位点： 茎长、叶长、花序数目、 花序长度、果壳长、果壳 宽度、每个花序的穗数。