siRNA细胞培养步骤

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siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。

一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。

可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。

由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。

下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。

若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。

1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。

接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。

注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。

可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。

2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。

（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。

注意孵育时间不能超过25min。

（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。

此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。

表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。

siRNA说明书

产品以冻干粉的形式，常温运输。

收到产品后，请于-20 C〜-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。

使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻融（尽量不超过5次）。

表120 gM储存液的配置参考使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。

实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。

细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。

推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24〜72h。

最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。

2. 转染步骤：以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。

1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。

注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。

2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。

上海细胞转染 rnaimax的si步骤

上海细胞转染rnaimax的si步骤在上海，细胞转染是一种比较常见的实验技术，可用于将siRNA引入细胞中，为研究基因功能提供了有力的手段。

在细胞转染rnaimax 的si 步骤中，需要注意以下几点。

1. 培养细胞：在进行细胞转染前，需要培养好细胞，并将其分装到相应的培养皿中。

通常情况下，选用的细胞应该呈现良好的生长状态，且需要在适宜的时间点进行转染操作。

2. 制备siRNA：在进行细胞转染的过程中，需要首先制备好siRNA。

siRNA的制备过程包括设计siRNA序列、合成siRNA、检测siRNA质量等步骤。

在这个过程中，需要严格控制siRNA的纯度、浓度和稳定性，以保证其在细胞内的有效性和安全性。

3. 准备细胞转染试剂：在进行细胞转染操作前，需要准备相应的转染试剂。

rnaimax 是一种常用的细胞转染试剂，能够有效地将siRNA引入到细胞内。

在准备rnaimax 试剂的过程中，需要按照厂家提供的说明书进行操作，以保证实验的准确性和稳定性。

4. 细胞转染操作：在进行细胞转染操作时，需要将制备好的siRNA 和rnaimax 试剂混合，形成一个转染复合物。

然后，将复合物倒入到培养皿中，轻轻地摇晃培养皿，使其均匀分布在细胞上。

在转染操作时，需要注意转染复合物的浓度、用量和时间等参数，以避免过度转染或者转染不足的问题。

5. 细胞处理：在细胞转染后，需要对细胞进行相应的处理。

通常情况下，处理方法根据实验需求而定，可包括药物处理、光学显微镜观察、RT-PCR检测、Western blot检测等。

在处理细胞时，需要注意实验条件的控制，以保证实验的准确性和可重复性。

总的来说，在上海进行细胞转染rnaimax 的si 步骤中，需要充分注意实验细节，严格控制实验参数，以获得可靠的实验结果。

同时，为了确保实验的成功，建议选择专业的实验室进行技术服务，以获得最佳的转染效果和数据结果。

siRNA 使用说明

siRNA 使用说明siRNA 使用说明一、简介siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种短双链RNA分子，能够特异性地靶向靶标基因的mRNA，从而抑制基因的表达。

本文档旨在提供有关siRNA的使用说明，包括实验准备、转染方法、验证转染效果等内容。

二、实验准备1、设计siRNA序列：根据目标基因序列，使用专业软件设计siRNA序列，确保合适的靶向位点和抑制效果。

2、合成siRNA：选取可靠的siRNA合成公司，按照其提供的合成方案进行合成，并确保纯度和浓度的准确性。

3、存储siRNA：将合成好的siRNA按照要求进行冻干或溶解保存，避免反复冻融对siRNA的影响。

三、细胞培养1、细胞系选择：选择适合的细胞系进行实验，一般常用的细胞系有HEK-293、HeLa、CHO等。

2、培养条件：按照细胞系的要求，配置好适合的培养基，并添加适当的血清和抗生素。

3、培养状态：维持细胞在良好的状态下生长，保持培养皿内细胞的完整和无菌。

四、siRNA转染1、转染试剂选择：根据不同细胞系的特点，选择适合的转染试剂，如RNMAX、Lipofectamine等。

2、转染条件优化：通过实验室预实验，优化转染试剂的用量、培养时间和上清液收集时间等参数。

3、转染操作步骤：a：将siRNA转染试剂溶解于无血清的培养基中，按照转染试剂说明书的推荐比例进行稀释。

b：将稀释后的转染试剂静置15-30分钟，直至形成转染试剂- siRNA复合物。

c：将复合物滴加到细胞培养皿中，保持培养皿在37°C的培养箱中进行适当的培养时间。

d：收集转染后的上清液，进行进一步的实验。

五、转染效果验证1、Real-time PCR：使用逆转录酶和合适的引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因表达水平的变化。

2、Western blot：通过Western blot实验检测目标蛋白的表达水平是否下调。

3、免疫荧光染色：利用免疫荧光染色技术观察目标蛋白在细胞中的表达情况。

细胞sirna转染操作流程

细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染是一种常见的实验操作，用于沉默特定基因的表达。

下面我将从多个角度全面地介绍细胞siRNA转染的操作流程。

1. 实验准备：a. 准备所需的细胞培养基、细胞培养皿、siRNA转染试剂（如Lipofectamine™ RNAiMAX等）、siRNA、目的基因的控制siRNA、PBS等。

b. 在转染前，需要将细胞培养至适当的密度，确保细胞处于良好的生长状态。

2. siRNA转染操作流程：a. 将需要转染的细胞计数并分配至培养皿中，使得在转染时细胞密度达到合适的水平。

b. 在一个离心管中混合适量的siRNA转染试剂和无血清培养基，轻轻振荡混合，并静置15分钟。

c. 将siRNA转染试剂混合物滴加到含有细胞的培养皿中，轻轻摇晃培养皿使转染试剂均匀分布。

d. 将细胞培养皿放回培养箱中，根据试剂的要求进行培养，通常在转染后的24-72小时内进行下一步实验。

3. 转染后处理：a. 根据实验需求，在转染后的适当时间点进行细胞的取样或者其他实验操作。

b. 如果需要进行长期实验或者观察，可以在转染后适当时间内更换培养基。

c. 对于不同的细胞系和siRNA转染试剂，最佳的转染条件可能会有所不同，因此需要根据实验要求进行优化。

总的来说，细胞siRNA转染是一个常用的实验技术，通过沉默特定基因的表达，可以帮助研究人员探索基因功能和细胞信号通路。

在进行操作时，需要严格按照试剂的说明书和实验要求进行操作，并且根据具体情况进行优化，以确保实验结果的准确性和可靠性。

希望这些信息能够帮助到你。

jetPRIME 转染siRNA说明书

JetPRIME 转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染，
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
●在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200μL的JetPRIME 缓冲液，然后加入20μM(1.1μL)
的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●加入4μL的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●室温孵育10min;
●将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
●必要时，转染后4h更换细胞培养基；
●孵育24-48h，检测转染效率。

不同规格培养皿的使用量
注：
siRNA enhancer的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA enhancer,其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。

细胞sirna转染操作流程

细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言近年来，细胞siRNA转染技术在生物医学领域中得到了广泛的应用。

该技术通过靶向靶标基因的mRNA，使用小干扰RNA (siRNA) 来沉默特定基因的表达，从而研究基因功能及其在疾病中的作用。

本文旨在介绍细胞siRNA转染的操作流程。

二、实验材料和设备1. 细胞培养基：含有适当的营养物质和补充物的培养基。

2. 细胞培养器具：细胞培养板、离心管、培养皿等。

3. siRNA转染试剂：包括转染试剂和转染缓冲液。

4. 离心机5. 显微镜6. 实验室安全设备：如实验室无菌操作台、手套、护目镜等。

三、细胞处理1. 培养细胞：将所要研究的细胞株在适宜的培养条件下培养至合适的生长状态。

2. 细胞传代：当细胞达到足够密度时，使用适当的方法将细胞传代到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态。

四、siRNA转染操作1. 转染试剂配制：按照转染试剂说明书的要求，将转染试剂稀释至适宜的浓度。

2. 转染试剂与siRNA混合：将所需转染试剂与合适浓度的siRNA混合，使其充分结合。

3. 细胞转染：将混合好的转染试剂和siRNA溶液滴加到培养皿中的细胞上。

4. 转染时间：根据实验需要，确定转染时间，并在转染后的适当时间点进行下一步实验操作。

5. 细胞处理：根据实验目的，对转染后的细胞进行相应的处理，如培养、药物处理等。

6. 细胞观察：使用显微镜观察转染细胞的形态变化、细胞数量等。

五、结果分析1. 蛋白检测：使用Western blot或免疫荧光技术检测转染后的细胞中目标蛋白的表达情况。

2. mRNA检测：使用RT-PCR或原位杂交等技术检测转染后的细胞中目标基因的mRNA水平。

3. 细胞功能分析：根据实验需要，进行细胞增殖、凋亡、迁移等功能分析实验。

六、讨论与展望细胞siRNA转染技术是一种有效的基因沉默方法，可以用于研究基因功能和疾病机制。

然而，该技术仍面临一些挑战，如选择合适的siRNA序列、提高转染效率等。

细胞sirna转染操作流程

细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特定的小干扰RNA (siRNA) 分子来抑制目标基因的表达。

本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程，以及该技术的应用和优势。

二、材料与方法1. 细胞培养：选择合适的细胞系，如人类癌细胞系HeLa，细胞应保持在优良的培养条件下，并处于快速增殖期。

2. 转染试剂：选择适合的转染试剂，如lipofectamine 2000等，根据试剂说明书进行操作。

3. siRNA设计与合成：根据目标基因序列设计合适的siRNA，确保siRNA具有高效的靶向作用和沉默效果。

4. 细胞培养基和缓冲液：准备含有适当浓度的无血清培养基和缓冲液。

三、操作流程1. 处理细胞：将细胞用适量的培养基悬浮在培养皿中，使细胞密度达到合适的转染浓度，一般为60-80%的细胞密度。

2. siRNA与转染试剂复合：将设计好的siRNA与转染试剂按照试剂说明书中的比例混合，并在室温下静置一段时间使其形成复合物。

3. 转染操作：将复合物缓慢滴加到细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿以保证复合物均匀分布在细胞上。

4. 培养细胞：将培养皿放入培养箱中，以适当的条件（如37℃，5% CO2）培养细胞一定时间，以便siRNA能够有效进入细胞并起到沉默目标基因的作用。

5. 细胞分析：根据实验需要，在转染后一定时间内收集细胞，进行相应的实验分析，如蛋白质检测、细胞增殖实验等。

四、应用与优势细胞siRNA转染技术广泛应用于生命科学研究中，可用于研究基因功能、新药靶点筛选、疾病机制探究等领域。

该技术的优势在于操作简便、效率高、靶向性强，并且可用于多种细胞系，适用范围广泛。

五、结论细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，通过引入siRNA分子抑制目标基因的表达。

本文介绍了细胞siRNA转染的操作流程和相关应用及优势。

随着该技术的不断发展，相信它将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。

jetPRIME转染siRNA说明书

JetPRIME转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染,
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200 ^L勺JetPRIME缓冲液，然后加入20卩M（1.1卩L）的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
加入4^L的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）;
室温孵育10mi n;
将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
必要时，转染后4h更换细胞培养基；
孵育24-48h，检测转染效率。

注：siRNA enhancer 的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA
en ha ncer其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。

siRNA转染方案

siRNA转染方案-向六孔板的每个孔种植2 x 10^5个细胞，每孔加入2ml不含抗生素的培养基注意：这个方案是针对六孔板中的一个孔，根据孔或皿的大小决定细胞和试剂的量。

-在含有CO2的37° C孵箱中培养细胞至60-80%融合。

这大概需要18—24小时。

注意：健康和不完全融合的细胞对于成功转染试验是必要的。

建议转染前一天要确保细胞存活。

-准备以下溶液：溶液A：每次转染，稀释2-8 μl siRNA duplex（例如0.25-1μg 或20-80pmol siRNA）至100 μl siRNA 转染基sc-36868溶液B：每次转染，稀释2-8 μl siRNA转染试剂sc-29528至100 μl siRNA转染基sc-36868。

6 μl siRNA 转染试剂可达高峰反应注意：不要向siRNA转染基sc-36868内添加血清和抗生素注意：最佳siRNA转染使用量对于不同目标蛋白是不同的，需通过实验来决定注意：如果需要低浓度siRNA，可用siRNA稀释缓冲液sc-29527稀释注意：尽管siRNA 转染试剂sc-29528对很多细胞系都是高效的，但可能不适用于所有细胞-直接将溶液A加入溶液B，然后用吸管上下轻柔吹打，室温下孵育15-45分钟-用2ml siRNA转染基sc-36868清洗细胞一次，吸出转染基立即进入下一步骤-每次转染，向溶液A和溶液B混合液中加入0.8ml转染基。

轻柔混合后用混合液覆盖冲洗过的细胞-将细胞放在含CO2的37℃孵箱孵育5-7小时注意：有些细胞可能需要长时转染。

然而长时血清饥饿可能会导致细胞分离或凋亡。

注意：结合了荧光素的对照siRNA只能在含CO2的37℃孵箱孵育5-7小时，孵育结束后利用荧光显微镜检测-加入1ml两倍血清浓度和抗生素浓度的正常培养基(2x正常培养基)，不要移除转染混合液。

如果有细胞毒性，移除转染混合液，用1x正常培养基替代-将这些细胞再孵育18-24小时-吸出培养基，用新鲜1x正常培养基取代-加入新鲜培养基24-72小时后利用合适的方案检测细胞注意：在siRNA试验中应该设立对照。

siRNA 使用说明

siRNA 使用说明siRNA 使用说明1.介绍siRNA（小干扰RNA）是一种能够特异性沉默靶基因表达的双链RNA分子。

本文档旨在提供关于siRNA的详细使用说明，包括实验前准备、实验步骤和数据分析等内容。

2.实验前准备2.1 选择siRNA：选择适合的siRNA靶向靶基因。

可以通过文献研究或生物信息学预测来确定siRNA的序列。

2.2 siRNA合成与纯化：合成和纯化siRNA应该由可靠的供应商进行。

确保合成的siRNA纯度高且无附加污染物。

2.3 细胞培养：选用适当的细胞系，并且按照常规细胞培养方法将其培养在适宜的培养基中。

3.实验步骤3.1 载体转染：将siRNA与特定的转染试剂混合，并按照转染试剂的说明书将其转染入细胞中。

注意控制组设置。

3.2 RNA干扰效率检测：根据靶基因的表达情况选择适当的方法检测siRNA的干扰效果，如定量PCR或Western blot等。

3.3 功能检测：根据实验需要，选择适当的功能检测方法，如细胞增殖、凋亡、迁移或侵袭等。

4.数据分析4.1 干扰效果分析：对实验结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并计算干扰效果的百分比。

4.2 功能检测结果分析：对功能检测结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并进一步解释其生物学意义。

5.附件本文档涉及的附件包括实验记录表、数据分析表和相应的图表。

请在需要时参考附加的文件。

6.法律名词及注释6.1 siRNA：小干扰RNA，一种双链RNA分子，用于特异性沉默靶基因表达。

6.2 RNA干扰：通过siRNA分子的特异性结合和降解，抑制靶基因的转录和翻译过程。

6.3 转染：将外源DNA或RNA导入靶细胞以实现外源基因的表达或干扰基因的沉默。

6.4 培养基：一种用于细胞培养的含有营养物质和生长因子的液体或固体培养基质。

7.结束语感谢您阅读本siRNA使用说明，希望本文档能帮助您顺利进行siRNA实验。

细胞sirna转染操作流程

细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的实验技术，用于研究基因功能和调控机制。

siRNA是一种短小的RNA分子，可以通过特定的转染方法送入细胞内，从而实现对特定基因的沉默。

本文将详细介绍细胞siRNA转染的操作流程。

二、实验前的准备1. 准备所需材料：包括细胞培养基、细胞培养器具、siRNA转染试剂、转染缓冲液等。

2. 培养细胞：将目标细胞培养至对数生长期，并确保细胞状态良好。

三、细胞siRNA转染操作流程1. 细胞处理a. 将细胞分装至培养皿中，使其达到适当的细胞密度。

b. 按照转染试剂的说明书，制备合适的转染混合液。

2. 转染操作a. 将转染混合液缓慢滴加至培养皿中，使其均匀分布在细胞上。

b. 轻轻摇晃培养皿，使转染混合液与细胞充分接触。

c. 将培养皿放回培养箱中，继续培养。

3. 转染后的处理a. 根据实验设计，确定转染后的时间点。

b. 在规定的时间点，进行下一步实验操作，如蛋白质表达分析、细胞功能研究等。

四、结果分析与讨论根据实验设计和细胞siRNA转染的目的，对实验结果进行分析和讨论。

可以通过Western blot、实时荧光定量PCR等技术手段来验证基因沉默效果，并进一步研究其对细胞功能的影响。

五、实验注意事项1. 选择适当的转染试剂和转染缓冲液，确保转染效率和细胞存活率。

2. 控制转染试剂的用量，避免过度转染导致细胞毒性。

3. 严格按照实验设计和操作流程进行实验，减少操作误差。

4. 注意实验室安全，遵守相关实验操作规范。

六、结论细胞siRNA转染是一种重要的实验技术，可以用于研究基因功能和调控机制。

通过合理的实验设计和操作流程，可以实现对特定基因的沉默，并进一步研究其对细胞功能的影响。

希望本文介绍的细胞siRNA转染操作流程能对相关研究工作者提供参考和指导。

沉默rna操作步骤

沉默rna操作步骤
沉默RNA（siRNA）是一种短小的双链RNA分子，可以通过RNA 干扰技术来抑制特定基因的表达。

以下是沉默RNA的操作步骤：
1. 设计siRNA序列，首先需要设计合适的siRNA序列，通常是21-23个碱基长，其中包括一个“sense”链和一个“antisense”链。

这两条链需要能够特异性地与目标基因的mRNA结合。

2. 合成siRNA，设计好siRNA序列后，可以选择将siRNA在实验室内化学合成，也可以购买商业合成的siRNA。

3. 细胞培养，将需要进行沉默RNA实验的细胞进行培养，确保它们处于良好的生长状态。

4. 转染siRNA，将合成好的siRNA转染入目标细胞中。

这可以通过多种方法实现，包括化学转染、电转染或基因枪等。

5. 培养细胞，转染后的细胞需要在培养皿中进行培养，确保siRNA能够进入细胞并发挥作用。

6. 检测沉默效果，通过实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧
光细胞染色等技术，可以检测目标基因的表达水平是否被沉默。

7. 功能实验，如果沉默效果良好，可以进行进一步的功能实验，观察沉默目标基因对细胞功能和表型的影响。

8. 数据分析，最后需要对实验数据进行统计分析和解释，确保
实验结果的可靠性和科学意义。

总的来说，沉默RNA的操作步骤涉及到siRNA序列设计、合成、转染、细胞培养和实验数据分析等多个环节，需要严谨的操作和耐
心的实验过程。

同时，实验者还需要具备一定的细胞生物学和分子
生物学实验技能，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。

siRNA 使用说明(两篇)

引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。

本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。

通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。

正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。

2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。

siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。

二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。

根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。

2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。

3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。

三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。

2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。

3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。

四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。

2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。

3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。

五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。

2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。

siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明 (2)

siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明产品介绍与其它转染试剂比较，siRNA-mate 转染效率高、细胞存活率高、毒性小。

可广泛用于瞬时和稳定转染，也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。

转染试剂保存在4℃，有效期2 年。

重要提示1. 细胞的状态：转染时贴壁细胞的密度以30 - 50%为佳，而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。

细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。

2. siRNA 的质量：使用高纯度的siRNA 也是转染成功的关键。

在转染前需确定siRNA 的含量和纯度，实验过程中需要使用DEPC 处理过的耗材和试剂，注意避免RNase 污染。

3. 血清的影响：在制备siRNA-mate和siRNA 形成复合体过程中不能添加血清，建议用OPTIMEM 或其他无血清培养基（如DMEM、RPMI-1640 等）稀释siRNA 和转染试剂，以达到复合物形成的最佳效果。

但是，在随后的转染过程中，血清的存在并不影响复合体的转染效果。

4. 转染试剂的用量：对于一定量的siRNA 建议尝试按照推荐剂量的siRNA-mate 转染试剂进行优化，以确定最佳的转染效率。

以24 孔板为例，每10pmol siRNA 可使用0.5 μl，1 μl，1.5 μl 和2 μl 转染试剂作为初步实验条件。

操作流程（24 孔板）以24孔板为例，若要检测基因沉默的效果，推荐最低siRNA 终浓度10 nM；若要在显微镜下从荧光强度看转染效率，因荧光信号被检测到需要一定的敏感度，推荐siRNA 终浓度50 nM。

遵循以下操作方法可以高效地将siRNA 转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。

但是对某些特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也许需要单独特别优化。

A. 细胞铺板贴壁细胞数量：在转染实验之前的18 - 24 个小时，在每个孔的500 μl 生长培养基中加入1.5 - 3.5 × 104 个细胞（确保转染时细胞密度在30- 50%）。

悬浮细胞培养及siRNA转染

悬浮细胞培养及siRNA转染1.悬浮细胞培养用T25的培养瓶，一般密度较少时培养基最多5ml2.换液，动作缓慢的将培养瓶拿出，将上面无细胞的培养基弃去2ml加入新鲜培养基置于37℃，5%CO2培养箱中培养3.传代培养，将细胞吹匀，计数后，将细胞放入离心管内进行离心，1000rpm，5min后，弃去上清，用新鲜培养基重悬后放入T25中进行传代置于37℃，5%CO2培养箱中培养4. siRNA转染24孔板中以2x105细胞/孔密度进行接种后（6孔板或96孔板接种密度进行相应调整）准备进行siRNA转染，实验每组设置3个复孔，siRNA以Nuclease-Free Water稀释至储存液浓度，通常为20 μM。

（实验组一般设置：阴性对照，阳性对照，空白对照，siRNA 实验组，其他siRNA荧光标签组（要避光保存））。

5.根据siRNA终浓度进行溶液配制（以下溶液配制以50 nM为siRNA 最终浓度，24孔板中终液体体积为500 μl为例），溶液1配制：每孔1.25 μl siRNA储存液以无血清无双抗培养基稀释至25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；溶液2配制：每孔2 μl Lipo 2000转染试剂（可用其他替代，用量参照说明书推荐或自行优化）以无血清无双抗培养基稀释到25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；上述2种溶液混匀后分别室温静置5min；6.将溶液1滴加至溶液2中并进行充分混合（每孔为50 μl），室温静置20-30 min；静置完成后，将上述混合液滴加进去24孔板中，每孔50 μl，注意滴加不要过快，以防冲起细胞，滴加完成后每孔加入450 μl无血清无双抗培养基，充分混匀，将板放入37℃，5%CO2培养箱中培养7.6h后，将板取出放入cytation5中看荧光显色，siRNA是否转染成功8.在细胞操做台上，将24孔中每孔细胞液移入1mlEP管内进行离心，6000 rpm离心5min，弃去上清，加入有10%FBS无双抗的培养基进行重悬后加入24孔板进行培养。

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。

细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

sirna提取方法

sirna提取方法主要包括以下步骤：
1.准备试剂和设备：准备所需的试剂，如盐酸、氯化钠、无水乙醇等，以及所需的设备，如离心机、
移液器等。

2.细胞培养和收集：将需要提取sirna的细胞进行培养，并通过离心机将细胞收集到离心管中。

3.细胞裂解和洗涤：将细胞加入裂解液中，通过剧烈搅拌或超声波破碎细胞，然后将破碎的细胞洗
涤多次，以去除杂质和蛋白质。

4.沉淀和洗涤：将洗涤后的破碎细胞加入乙醇，通过离心机沉淀出核酸，再次洗涤核酸沉淀，以去
除残留的乙醇和其他杂质。

5.溶解核酸：将核酸沉淀溶解在适当的水或缓冲液中，然后进行进一步的纯化和处理。

6.去除蛋白质和残留碎片：通过离心机去除蛋白质和残留的碎片，以确保sirna的纯度和质量。

7.浓缩和干燥：将核酸溶液进行浓缩和干燥，以便于后续的实验和应用。

需要注意的是，sirna提取方法的具体步骤和试剂可能因实验需求和细胞类型而有所不同。

在实验前应该了解相关文献和资料，并选择适合自己实验的方法和试剂。

同时，为了保证实验的准确性和可靠性，应该遵循实验室安全规范，并确保所有试剂的质量和来源可靠。

细胞培养标准流程

细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min)。

显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。

超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。

带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。

基培需写上开启时间。

细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。

所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。

步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2。

弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。

消化：加入1ml 0。

25％胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min，，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。

5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化。

6。

吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿.再加入10ml全培。

（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7。

培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况.PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）细胞接板24 h 后转染。

转染时细胞密度需达到70-90%。

以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。

取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。