干化学技术与应用

干化学技术与应用

所谓“干化学”是与传统的“湿化学”（即溶液化学）相对比较而言的。它是以被检测样品中的液体作为反应媒介，待测物直接与固化于载体上的干粉试剂反应的一种方式。它与传统湿化学的最大区别就在于参与化学反应的媒介不同。随着生物化学中酶的分离、提纯、存储等技术的发展，传感器、光度计和电极技术的进步，以及计算机应用的普及，干化学技术在近20年里得到了长足的进步，相对于“湿化学”，“干化学”具有如下优点：

干化学试剂载体的结构干化学试剂载体的结构分为二层结构，三层结构，和多层膜。

最简单的二层结构

用于生化分析的试剂载体最简单的是二层结构，在支持层塑料基片上有一试剂层纤维素片，在纤维素片中预固相了全部试剂。常见的是尿生化分析试剂条：

尿液中的待测成分与预固相在纤维素片上的试剂直接反应，通过反射光度计测定其颜色的改变，从而计算待测成份的浓度。这种机构只能对待测成分进行定性或半定量测定，这样就限制了它在其它须准确定量的标本的应用。

稍加改进的三层结构

在试剂层上加一多孔胶膜过滤层，其作用是将样品中的杂质过滤掉，并起保护试剂层作用。常见的是微量法测定葡萄糖的试剂条。

三层试剂载体的测定光路是通过透明的塑料基片，而不经过最上面的过滤层，这样消除了样品中干扰成分的影响，保证了待测成分测定的稳定性和准确性。

比较完善的多层膜

当代临床检验中的干化学法，最具代表性的就是多层膜法，即干化学的多层膜试剂载体。它集现代化学、光学、酶工程学、化学计量学和计算机技术于一体。

多层膜分为三种类型：比色/速率法干片、离子法干片和免疫速率法干片

1.1 介绍比色/速率法干片

比色/速率法干片主要用于常规生化项目的测定，干片模式图(图1)显示了一个临床化学比色/速率法干片模式简图。在这个试剂片中，多种反应试剂被固化在一张透明聚酯膜上，上面覆以多孔的扩散层，然后被夹在一个塑料结构中。如图所示，共有4个功能层：扩散层、试剂层、指示剂层和支持层。每个试剂片的层数视所采用的分析方法而定，干片的大小大致与一枚邮票相同，显色剂层呈现的颜色深浅与待测物浓度成正比。

扩散层：扩散层的概念最早是由柯达研究实验室Edwin Przybylowic博士提出的，是由TiO2,BaSO4和醋酸纤维素构成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔径在1.5－30微米之间。扩散层的孔径和厚度将取决于特定分析的需要。扩散层的中空体积占40%－90%，这种毛细网状结构能使样品溶液快速、均匀地分布到下层。当一滴样品约10微升加在试剂片上后，毛细作用将样品迅速吸入多空扩散层，但样品在一瞬间被下面的凝胶层所排斥，因为凝胶层在接受血清组份之前，必须先生成水合物。

扩散层不仅可阻留细胞，结晶和其他小颗粒，它也可以根据需要让大分子，如蛋白质等滞留。当待检样品通过扩散层后，可以消除溶液中影响检测反应干扰物质。扩散层中的TiO2和 BaSO4.一方面可用来掩盖待检样品中的有色物质，使反射光度计的测定结果不受影响，同时这些反光化合物也给干片底层的显色层提供反射背景。在一些特定试剂片中，扩散层中还含有选择性阻留某种成份或启动某种反应的物质，以提高分析的特异性。

试剂层：在化学试剂层中，根据实际测定的需要，可由数层至数十个功能试剂层组成。反应区的功能是将待测物通过物理、化学或生物酶学等反应转化为可与显色剂结合的化合物。试剂层中按照反应的顺序涂布了不同的化学试剂，使反应按照预先的设定依次进行。针对不同检测项目的个性化设计为化学反应提供了最理想的物理和化学反应环境－这就是为什么干化学技术能够确保更准确的试验结果。尿酸干片是使用清除剂层的一个示例。清除剂层含有抗坏血酸氧化酶，用于将抗坏血酸（维生素 C）（一种内源性干扰物）转化，对试剂层中所发生反应不产生干扰。

指示剂层：反应底物进入指示剂层，在这里发生显色反应。此层包含染料或相似的指示剂，使反应产物到达指示剂层后生成了有色化合物，其颜色变化与分析物浓度成比例，被反射光检测。

支持层：此层是透明塑料制成，起到支持其它层的作用，且允许光线百分之百透射，以便对有色复合物进行测量。

颜色变化通过反射光检测，由于光线不通过已经被阻留在扩散层上的潜在干扰物，从而避免了对检测结果的干扰。因为多层的设计，不同的项目加入了特殊的试剂层增强反应的特异性，干化学具有优异的抗干扰能力。结合非结合胆红素 (BuBc) 干片是使用屏蔽层的一个示例。屏蔽层可有效阻隔可能的干扰成分（例如，血红蛋白）以防其进入扩散层，从而防止它们影响测量结果。

1.2 直接选择性电极离子检测干片

离子（钠，钾，氯）检测是干化学检测项目中的传统优势项目，采用离子法干片。其设计采用直接电势法，样本无需稀释。离子干片是由纸桥将两个离子选择性电极相连，通过电压表来测量患者样本和已知参比液之间的电势差，从而计算出钠，钾，氯的离子浓度。

1.3 免疫速率法干片

免疫速率法干片主要用于进行药物浓度和蛋白质检测，分为竞争法和非竞争性干片两类。

I. 竞争法（例如地高辛）

读数时采用了多点速率法来检测分析物浓度。分析物与酶标抗原竞争有限数量的抗体结合位点。加入含底物的免疫洗液，一方面洗去未结合物质，另一方面抗原抗体复合物与无色底物反应显色以670nm波长加入免疫洗液并孵育2.5min后读数；通过速率的变化采计算分析物浓度，发射光密度与分析物浓度成反比。

II. 非竞争法（CRP）

读数时采用定点速率法。待测物与固相抗体、酶标抗体形成夹心“三明治”。加入含底物的免疫洗液后洗去读数视窗区域未结合物质，抗原抗体结合物与底物反应显色，孵育2.5分钟时读数670nm发射光密度与待测物浓度成正比。

1 反射光度法的原理――干化学分析法的理论基础

反射光度法依据反射介质不同，有多种理论。光线进入介质后出现下列效应：

－在照射表面产生反射（和折射）

－内部吸收

－在内部或照射表面产生散射

这些效应的总和决定了光再离开介质的比率和方向。反射光密度与分析物浓度不呈线性关系的原因是检测到的光信号包含了反射光和散射光。光通过各层干片时，干片内部各个层和表面会产生散射和反射。

检测比色/速率和免疫速率法干片时采用的是反射分光光度法。强生干化学技术反射光理论是Williams,Clapper等提出的。在仪器内部光源发出一束光透过透明支持层，在试剂层光被有色化合物部分吸收后，在扩散层提供的反射面被反射，反射光经滤光装置后回到光度检测器被读数。光密度由此被转化为电压读数，并计算成分析物浓度。

干化学技术中入射光（IO）100%进入干片。有色物质吸收一定比例光后反射。反射法检测反射光（IR），反射比为R= Ir/Io 反射光密度（DR）公式为DR=log10

反射法中，分析物浓度与DR不成比例关系。

C不等于Ao（截距）+A1（斜率）*DR

虽然不呈线性关系，但是结果仍然可以预测。严密的研究建立了患者标本浓度与反射光密度间的数学关系。通过一个函数就可完成二者间转换。函数关系是使用前通过定标盘载入检测系统，通过函数实现每种测试项目的转换。

通用定标模式

这是用来把仪器检测光密度与分析物浓度建立关联的通用公式。A0、A1、A2是未知的，需经定标程序计算得出。g(DR)是将检测光密度与分析物浓度关系线性化的转化函数。K在每项测试中是已知常数。