仪器分析第四章 高效液相色谱
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梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压 泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将 两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再 输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按 一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量， 在高压下混合。
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
二、HPLC仪器
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图所示。
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
3. HPLC与GC的比较
c. 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于 色谱分离条件的选择。
d. 柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中， 柱外区域扩张可以忽略不计。
e. 使用成本：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测 器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互 相补充的。
综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、 灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术 的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科 学领域获得广泛的应用。
4. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种
溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定
相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小
的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或 洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的 保留行为。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检 测器——10-11g。
3. HPLC与GC的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性 等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相 色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条 件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下 几方面：
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液 分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色 谱等类型。
2. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速 度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次 分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传 质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
分离柱
压力计
反压调节
注样阀
过滤器
1. 高压输液系统
1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防 止颗粒物进行泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
3）高压泵： 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中
的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过 程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀， 流量精度和重复性为0.5%左右。
输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
第四章 高效液相色谱
1. 概述 2. HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法各论
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
1. 液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动 相组成。
a. 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、 热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。
b. 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对 组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改 进分离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、
分 子
药品、多糖、高聚物、农药、 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次， 因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻 尼器)。
马达
Hale Waihona Puke Baidu密封
往复式拉动
到色谱柱 脉动阻 尼器
球阀
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
4）梯度洗脱：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子 强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压 泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将 两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再 输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按 一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量， 在高压下混合。
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
二、HPLC仪器
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图所示。
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
3. HPLC与GC的比较
c. 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于 色谱分离条件的选择。
d. 柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中， 柱外区域扩张可以忽略不计。
e. 使用成本：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测 器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互 相补充的。
综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、 灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术 的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科 学领域获得广泛的应用。
4. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种
溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定
相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小
的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或 洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的 保留行为。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检 测器——10-11g。
3. HPLC与GC的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性 等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相 色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条 件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下 几方面：
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液 分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色 谱等类型。
2. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速 度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次 分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传 质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
分离柱
压力计
反压调节
注样阀
过滤器
1. 高压输液系统
1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防 止颗粒物进行泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
3）高压泵： 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中
的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过 程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀， 流量精度和重复性为0.5%左右。
输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
第四章 高效液相色谱
1. 概述 2. HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法各论
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
1. 液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动 相组成。
a. 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、 热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。
b. 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对 组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改 进分离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、
分 子
药品、多糖、高聚物、农药、 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次， 因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻 尼器)。
马达
Hale Waihona Puke Baidu密封
往复式拉动
到色谱柱 脉动阻 尼器
球阀
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
4）梯度洗脱：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子 强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。