仪器分析第四章 高效液相色谱
《仪器分析》高效液相色谱法
《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支，是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为仪器分析中的一种常用方法，具有快速、高效、灵敏度高等特点，在许多领域得到广泛应用。
高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法，其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离，再通过检测器对各个化合物进行定量测定。
高效液相色谱法相比传统的液相色谱法，具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点，从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。
高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析，例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。
以药物分析为例，在药物研发和质量控制中，高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标，从而保证药品的质量和安全性。
而在环境分析方面，高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物，为环境保护提供科学依据。
此外，高效液相色谱法还可以用于食品安全监测，检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质，保障人民群众的身体健康。
高效液相色谱法的操作相对简单，但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。
首先，需要选择合适的色谱柱和填充剂。
不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂，以获得最佳的分离效果和分辨率。
其次，需要合理选择流动相的组成和流速。
流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果，因此需要经过调试和优化。
最后，还需要进行准确的定量分析。
在高效液相色谱法中，常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等，可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。
综上所述，高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法，具有广泛的应用领域和潜力。
在实际应用中，需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂，合理选择流动相的组成和流速，并进行准确的定量分析。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
仪器分析高效液相色谱PPT课件
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6.1.6 离子交换色谱法
离子交换色谱法
固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，
在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基
阳离子交换树脂
在表面未端芳环上接上季胺基
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
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6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
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分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离
的一种色谱方法。 ➢ 以凝胶 (gel) 为固定相，它类似于分子筛， 但凝胶的孔径比分子筛要大得多。
➢ 凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量 的化合物可以进入孔中，滞留时间长；中等 体积的分子部分渗透；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。
荧光检测器——10-11g。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱法—认识高效液相色谱法(仪器分析课件)
二、高效液相色谱法的基本原理
基本原理：
混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流动相 和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力的 不同，随流动相在两相间进行反复多次分配过程，经过 一定长度的色谱柱，彼此分离开来，最后按一定顺序流 出。
三、高效液相色交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种 离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同 孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。
2.分配色谱（液-液分配色谱）
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相，现多为化学键合 固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。
三、高效液相色谱法的主要分离类型
一、高效液相色谱法的基本概念
二、高效液相色谱法的基本原理
三、高效液相色谱法的主要分离类型 四、HPLC与GC的比较
一、高效液相色谱法的基本概念
基本概念：在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵 敏度的在线检测器，是一种新型分离分析技术。
特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。
四、HPLC与GC的比较
1）应用范围不同 液相色谱非常适合分子量较大、难气化等物质的分离分析。
2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 ① 可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离 的选择性。 ② 液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大。 ③ 液相色谱通常在室温下操作。
高效液相色谱法—高效液相色谱法的应用(仪器分析课件)
二、流动相的制备
• 新型的高效液相色谱仪多用专用的在线真空 脱气技术。真空脱气装置串联到储液系统中， 并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵 前的连续真空脱气。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱仪使用操作技 能
02 掌握高效液相色谱仪各部分操作技能 相关标题文字
高效液相色谱法实验技术
学生分组练习
根据实验室的实际情况，安排学生分组练习， 一部分学生练习配制流动相，一部分学生练习 操作仪器(以苯试样为例）。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱法的应用技
术
02 掌握流动相配制及制备技术
项目三 高效液相色谱法应用
03
——流动相的配制
·流动相的配制 ·流动相的脱气方法
复习： 高效液相色谱仪是以液体为流动相，高压泵将贮 液瓶中流动相经过进样器送入到色谱柱，然后从 废液口中流出；样品经进样器注入后，流动相将 样品带入到色谱柱进行分离，分离后的组分依次 先后顺序进入检测器。记录仪将检测器的信号记 录下来，得到液相色谱图。
➢2.取混合均匀的溶液， 经0.45µm的有机膜过滤， 再脱气15分钟即可
二、流动相的制备
➢3.将过滤好的流动相装入到流动相的储液瓶中， 然后进行脱气
二、流动相的制备
• 4.脱气方法：
• 常用的方法有吹氦脱 气法、加热回流法、 抽真空脱气法、超声 脱气法。以上几种方 法是离线脱气法，在 流动相存放过程中又 会有空气重新溶解在 储液系统中，
高效液相色谱法实验技术 操作过程演示3
观察废液出口，若没有气泡，按“Purge”鍵，停止排 放，关闭排放阀。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
仪器分析第四版高效液相色谱
4、示差折光检测器
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
放大器
参比
光学零
光电转换 调零
记录仪
溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束 光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度
通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml
对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗
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四、 检测系统
5、安培检测器
利用待测物在工作 电极表面发生反应产生 电流，此电流大小与待 测物浓度成正比。
常用的低粘度溶剂：甲醇、乙腈等 粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等
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二、流动相——淋洗液，洗脱剂
2、流动相组成
按组成不同：单组分和多组分； 按极性：极性、弱极性、非极性； 按使用方式：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂: 四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 、乙腈、甲醇、水。
二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性
固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上
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四、高效液相色谱
（一）高效液相色谱（HPLC）含义： 高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器
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死时间(tM):完全不保留组分流出系统的时间 保留时间(tR):
调整保留时间(t’R): tR' tR tM
死体积(VM): VM tMF0 保留体积(VR): VR tRF0 调整保留体积(V’R): V R ' tR ' F 0(tRtM )F 0
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三、固定相和流动相的选择
正相色谱：极性固定相——非极性流动相（加极性
调节剂如氯仿）——极性柱（正相柱）
反相色谱：非极性键合固定相（ODS）——极性
流动相——非极性柱（反相柱）
仪器分析高效液相色谱法
离子交换色谱法适用于分离离子化合物，如氨基酸、核酸等。在分离过程中，离子交换剂对不同离子的亲和力不 同，通过改变流动相的离子强度和种类，可以实现对不同离子的分离。
体积排阻色谱法
总结词
利用固定相孔径大小排除不同大小的分子进行分离。
详细描述
体积排阻色谱法适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。在分离过程中，固定相的孔径大小不同 ，能够排除不同大小的分子，从而实现分离。该方法具有较高的分辨率和分离效果。
检测
通过检测器对分离后的组分进 行检测，记录数据并进行后续
分析。
03
高效液相色谱法的分离模式
正相色谱法
总结词
利用极性固定相吸附剂，对极性物质的吸附作用进行分离。
详细描述
正相色谱法适用于分离极性物质，如醇、胺、水溶性氨基酸 等。在分离过程中，固定相的极性大于流动相的极性，极性 物质在固定相上的吸附力较强，因此能够得到较好的分离效 果。
金属、霉菌毒素等，保障食品安全。
生物医学研究中的应用
生物分子分离纯化
高效液相色谱法可用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等， 为生物医学研究提供高质量的样品。
药物代谢和药代动力学研究
通过高效液相色谱法检测药物在体内的浓度和代谢产物，有助于了 解药物的作用机制和代谢途径。
临床诊断和生物标志物分析
高效液相色谱法能够检测生物体中的生物标志物，如氨基酸、脂肪 酸、激素等，为临床诊断和疾病研究提供重要信息。
食品分析中的应用
食品添加剂分析
01
高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂，如防腐剂、色素、
甜味剂等，确保食品质量和安全。
营养成分分析
02
通过高效液相色谱法测定食品中的维生素、矿物质和其他营养
仪器分析第四版高效液相色谱
根据需要调整色谱柱温度，以改善 分离效果和峰形。
04
定性与定量分析方法
定性分析
通过比较标准品和样品的保留时 间和峰形进行定性分析，或使用 其他辅助手段如质谱进行确证。
定量分析
使用标准曲线法进行定量分析， 绘制标准曲线并计算样品的浓度 或含量。注意标准品的纯度和保 存条件对定量结果的影响。
数据处理与报告
解决方案包括开发环保型溶剂和固定相，以及采用低能耗的分离技术。
未来展望
拓展应用领域
随着技术的不断创新和发展，高效液相色谱法将在更多领域得到应用，如环境监测、食品安全、 生物医药等。
提高分析效率
通过改进仪器设计、优化实验条件和提高自动化程度，进一步提高分析效率，满足快速、准确分 析的需求。
加强与其他技术的联用
色谱柱安装
正确安装色谱柱，避免柱头损坏和气泡产生。
系统平衡
在进样前，让系统在一定流速下平衡一段时 间，以确保基线稳定和重现性。
样品处理与进样技巧
样品溶解
选择合适的溶剂将样品溶解，避免使 用强酸强碱或高盐溶液。
样品过滤
使用合适孔径的滤膜过滤样品溶液， 去除杂质和颗粒物。
进样量控制
根据色谱柱容量和检测器灵敏度，选 择合适的进样量，避免过载或灵敏度 不足。
环境毒理学研究
利用高效液相色谱法分析生物体内污染物的 代谢产物和毒性效应，评估环境污染物对生 态系统和人类健康的影响。
生物医学领域应用
药物分析
高效液相色谱法可用于药物的质量控制、纯度分析和含量测定， 确保药物的安全性和有效性。
生物样品分析
通过高效液相色谱法分离和检测生物样品中的生物活性物质，如激 素、代谢产物等，研究生物体的生理和病理过程。
仪器分析—高效液相色谱法
仪器分析—高效液相色谱法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和定量化学物质的分析技术。
它广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
HPLC的原理基于样品在流动相中的分配行为，通过调节流动相成分和流速，实现对样品中化合物的分离和定量。
HPLC的特点之一是分离效率高。
其分析柱内有高效填料，通常是细小颗粒的吸附剂，能够提供大的表面积，有效地增加了分析柱与流动相接触的面积，从而提高了分离能力。
此外，在HPLC中还可以根据需要选择适当的流动相，调节柱温和压力等条件，进一步优化分析条件，提高分离效果。
其次，HPLC的灵敏度高。
在HPLC中，使用的检测器通常有紫外-可见光谱法、荧光法、质谱法等。
这些检测器可以实现对特定化合物的高选择性检测，而且还能够对不同化合物进行同时检测。
对于低浓度的化合物，可以通过选择合适的检测器和优化分析条件，提高检测灵敏度，使得即使在样品中含量很低的化合物也能够被准确地检测到。
此外，HPLC在分析速度和样品处理方面也比较快捷。
与传统的柱色谱技术相比，HPLC使用的高压泵可以提高流动相的速度，从而缩短分析时间。
对于样品预处理方面，使用HPLC时只需要进行简单的处理，如溶解样品并过滤，就可以直接进入分析阶段。
这使得HPLC具有高通量分析的优势，能够在短时间内快速分析大量样品。
此外，HPLC还可与其他技术结合应用。
例如，HPLC-质谱联用技术可以实现对样品中化合物的分离和结构的同时鉴定，具有非常高的分析灵敏度和选择性。
HPLC还可以与色谱预处理、液相萃取和样品前处理等技术结合，提高样品的净化效果和检测灵敏度。
综上所述，HPLC是一种高效、灵敏和多功能的分析技术，被广泛应用于各个科学领域。
它的分离效率高，灵敏度高，分析速度快，样品处理简便，可以与其他技术结合使用，提高分析的效果和可靠性。
在今后的科学研究和实际应用中，HPLC将继续发挥重要的作用。
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
第四章高效液相色谱分析法
第四章高效液相色谱分析法高效液相色谱（HPLC）是一种现代化的色谱技术，该技术利用高压将溶液推入柱中，然后在固定相上进行分离。
HPLC技术广泛应用于化学、生化、生物医药、环境等领域的分析与研究。
HPLC的分析原理是利用样品中所含化合物与柱填料固定相之间的体积作用力及化学作用力来进行分离。
在HPLC系统中，样品经过样品进样器注入进样回路中，通过高压泵将样品溶液送入柱中，柱中填充有固定相，样品中的成分在固定相表面上进行吸附与解吸，其中一些化合物会更容易与固定相相互作用，因此分离出来。
分离后的化合物通过检测器进行检测和定量。
HPLC技术具有高效、灵敏、精确、稳定等特点。
相比传统色谱技术，HPLC具有较高的分离效率和灵敏度。
其中，分离效率是指单位时间内分离出的化合物的数量，而灵敏度是指仪器能够检测到的最低浓度。
通过调节柱填料、流动相组成和流速，可以实现对复杂样品的高效分离和定量分析。
HPLC技术有多种模式，包括正相色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、分子筛色谱法等。
其中，反相色谱法是最常用的一种模式。
反相色谱法是指固定相是非极性的，而流动相是极性溶剂的情况下进行的色谱分离。
通过调整流动相的溶剂极性和流速，可以实现对不同极性化合物的分离。
除了分离功能外，HPLC还可以与其他技术联用，如质谱、荧光、紫外-可见光谱等。
这种联用技术结合了不同的分析方法，可以提高分析的特异性和灵敏度。
例如，将质谱与HPLC联用可以对化合物的结构进行确认和鉴定，而将荧光和HPLC联用可以对化合物进行特异性的定量分析。
HPLC技术在各个领域有着广泛的应用。
在化学领域，HPLC可以用来分离和分析复杂化合物，如天然产物的提取和纯化，药物的分析和鉴定等。
在生物医药领域，HPLC可以用来分析药物的含量、纯度和杂质，以及药物代谢产物和血液中的生理活性物质。
在环境领域，HPLC可以用来检测水体、土壤和空气中的有害物质，如重金属、有机污染物和农药残留等。
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4. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压 泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将 两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再 输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按 一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量， 在高压下混合。
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
二、HPLC仪器
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图所示。
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种
溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定
相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小
的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或 洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的 保留行为。
第四章 高效液相色谱
1. 概述 2. HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法各论
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
1. 液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动 相组成。
的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过 程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀， 流量精度和重复性为0.5%左右。
输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检 测器——10-11g。
3. HPLC与GC的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性 等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相 色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条 件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下 几方面：
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液 分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色 谱等类型。
2. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速 度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次 分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传 质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
3. HPLC与GC的比较
c. 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于 色谱分离条件的选择。
d. 柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中， 柱外区域扩张可以忽略不计。
e. 使用成本：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测 器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互 相补充的。
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次， 因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻 尼器)。
马达
密封
往复式拉动
到色谱柱 脉动阻 尼器
球阀
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
4）梯度洗脱：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子 强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
分离柱
压力计
ห้องสมุดไป่ตู้
反压调节
注样阀
过滤器
1. 高压输液系统
1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防 止颗粒物进行泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
3）高压泵： 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中
a. 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、 热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。
b. 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对 组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改 进分离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、
分 子
药品、多糖、高聚物、农药、 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换