微生物限方法学验证
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度方法学验证方案
微生物限度方法学验证方案1.实验目的：本实验的目的是确定产品中大肠杆菌的数量，以评估其微生物污染程度，并验证产品是否符合相关规定的微生物限度标准。
2.实验材料和仪器：-试样：待测试的产品样品（如药品、食品等）-培养基：亚洲太平洋社会协调委员会（APHA）液体培养基或平板培养基-培养器具和耗材：试管、平板、无菌纱布、无菌拔火棉、无菌吸管、无菌移液器、无菌塑料培养瓶等-仪器设备：恒温箱、培养箱、显微镜等3.实验步骤：3.1样品制备：将待测试产品样品均匀涂布于无菌培养基平板上，根据需要，将不同稀释度的样品分别涂布于多个平板上。
3.2培养：将涂布好样品的平板放入恒温箱或培养箱中，在适当的温度（通常为37°C）下培养一定时间（通常为24小时）。
在培养的过程中注意保持无菌环境。
3.3平板计数：在培养完成后，检查每个平板上的菌落形成情况。
根据实验需要，可以选择不同的方法进行菌落计数。
常见的方法有手工计数和自动计数仪器。
例如，使用显微镜进行手工计数，或使用自动计数仪器进行电子计数。
3.4数据处理：根据菌落计数结果计算大肠杆菌的数量，并将结果与相关的微生物限度标准进行比较。
如果实验结果符合标准，则产品可被视为合格；如果结果不符合标准，需要采取相应的控制措施，如重新调整产品配方、改变生产工艺等。
4.实验注意事项：-所有试验操作都必须在无菌环境中进行，以避免结果被外源性微生物污染。
-使用符合相关质量标准的试剂和培养基。
-实验前应进行适当的预试验，以确定最佳的稀释度和培养条件。
-大肠杆菌计数要根据不同的产品、数量和国家的相关标准来确定。
-实验结果的准确性和可靠性需要重复试验和验证。
通过以上实验步骤和注意事项，可以进行微生物限度方法学验证，确定产品中大肠杆菌的数量，并评估其微生物污染情况。
这个验证方案可以用于药品、食品和其他产品的质量控制和安全评估。
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证是一种用于确定化妆品和药品中微生物污染水平的方法。
这种验证方法用于确定产品是否符合微生物限度规定，并确保产品的安全性和质量。
微生物限度方法学验证的步骤包括：
1. 根据相关规定选择适当的微生物限度测试项目。
常见的微生物测试项目包括总生菌数、霉菌和酵母菌、大肠菌群等。
2. 准备适当的培养基和培养条件，以促使微生物在培养基上生长。
3. 从样品中获取适当的微生物培养物。
样品可以是产品中的一部分或整个产品。
4. 在适当的培养基上接种微生物培养物。
5. 在适当的环境条件下孵育培养基，以促进微生物生长。
6. 定期检查培养基的生长情况，包括观察菌落形态和计数菌落数量。
7. 将菌落转移到适当的检测方法中，如涂抹法、膜过滤法等。
8. 使用适当的培养基和培养条件，在适当的温度和pH条件下，观察和计算培养基上的微生物生长数量。
9. 比较结果与规定的微生物限度标准，确定产品是否符合要求。
微生物限度方法学验证可以帮助制药和化妆品行业确保产品的微生物质量，并确保产品在使用过程中不会对消费者的健康有害。
这种验证方法需要严格的实验室操作和合理的测试标准，以确保结果的准确性和可靠性。
微生物限度检查方法验证方案
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解
国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证微生物限度方法学验证是指通过一系列的实验和分析，确定某一产品或样品中所含微生物的数量和种类。
它是一种质量控制的重要手段，用于评估产品的微生物污染情况，确保产品符合安全要求。
微生物限度方法学验证通常包括以下几个步骤：1. 确定样品的限度：首先，需要确定限度的范围。
在国家标准和相关规范中，通常会对不同产品的微生物限度进行规定，根据产品的特性和用途，设定了不同的限度要求。
因此，在进行验证之前，需要先明确所要验证的产品的限度。
2. 提取样品：根据所要验证的产品特性，选择适当的方法提取样品。
提取样品的目的是将样品中的微生物完全释放出来，以便后续的实验分析。
3. 预培养或净化：在某些情况下，样品中的微生物数量非常少，无法直接进行分析。
此时，需要进行预培养或净化操作，增加微生物数量或减少其他杂质的干扰。
预培养可以使用适当的培养基，为微生物提供生长所需的营养物质和条件。
净化操作可以通过滤膜、离心等方法，将大部分的杂质去除。
4. 微生物分离和鉴定：将样品进行稀释处理，并分别均匀涂布在适当的培养基上。
在一定的时间和温度条件下，培养基上会出现不同形状和颜色的菌落。
通过观察菌落的特征、形态学和生理学测试，可以大致判断出菌落所属的微生物种类。
5. 统计分析：通过对微生物菌落进行计数，并根据所设定的限度要求进行统计分析。
常用的统计方法包括平板计数法、薄膜过滤法和浸入法等。
统计分析的结果可以得知样品中微生物的数量和种类，进而判断样品是否符合限度要求。
6. 结果判定：根据统计分析的结果，结合所设定的限度要求，判断样品是否合格。
如果样品中的微生物数量和种类在限度范围内，并且符合相关标准要求，那么样品可以被认为是合格的。
微生物限度方法学验证具有一定的复杂性和技术难度，需要操作人员具备一定的实验室技术和知识。
同时，验证过程中要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，验证结果需要及时记录和整理，以便对产品质量的稳定性进行评估和改进。
微生物限度检验方法验证报告
微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
7
7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。
稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。
7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。
附录。
药品微生物限度检查方法学验证的研究进展
培养基的灭菌
培养基的灭菌
灭菌是保证培养基质量的另一个重要环节。只有经过灭菌处理的培养基才能 在药品微生物限度检查中使用。
1、灭菌方法
1、灭菌方法
培养基的灭菌方法主要包括高压蒸汽灭菌和干热灭菌。其中，高压蒸汽灭菌 是一种常用的灭菌方法，可以有效杀灭细菌、病毒等微生物，且不会对培养基成 分造成破坏。干热灭菌则是将培养基进行高温烘烤以达到灭菌效果，但容易导致 培养基营养成分损失。
结论
结论
药品微生物限度检查方法学验证目前存在的主要问题是灵敏度、特异性和现 实应用等方面，需要进一步研究和探讨。本次演示提出了一些可行的解决方案和 发展建议，以期为药品微生物限度检查方法学验证的进一步研究提供参考。随着 科学技术的发展和药品监管政策的不断更新，我们相信未来药品微生物限度检查 方法学验证将会取得更为显著的进展和成果。
药品微生物限度检查方法学验 证的研究进展
01 摘要
03 研究现状
目录
02 引言 04 研究方法
目录
05 结果与讨论
07 参考内容
06 结论
摘要
摘要
药品微生物限度检查是保障药品安全性的重要手段，而方法学验证则是其关 键环节。本次演示旨在探讨药品微生物限度检查方法学验证的现状、存在的问题 及未来发展方向。通过对细菌、真菌、支原体等微生物类别的方法学验证进行综 述，发现当前的主要问题是灵敏度、特异性和现实应用等方面。本次演示提出了 一些可能的解决方案和发展建议，以期为药品微生物限度检查方法学验证的进一 步研究提供参考。
参考内容
内容摘要
药品微生物限度检查是保证药品质量和安全性的重要手段之一。而培养基的 配制、灭菌和贮存效期验证则是药品微生物限度检查的关键环节。本次演示将就 这些方面进行详细的介绍。
微生物限度检查方法的验证
1. 目的（PURPOSE）规范微生物限度检查方法验证，确保微生物限度检验方法的结果准确可靠2. 适用范围（SCOPE）微生物限度检查方法验证的起草实施及报告3. 职责（RESPONSIBILITY）微生物实验室对本程序的执行负责4. 关键词（KEY WORDS）微生物限度检查方法验证5. 定义（DEFINITION）不同的检品、不同的检测仪器、试液和培养基及实验环境条件等均可能对检验结果产生影响。
在检验实践中，主要是以下几种因素对微生物检查产生影响：(1) 药品本身的抑菌性(2) 药品中防腐剂的抑菌性(3) 培养基的促菌生长能力(4) 培养条件(5) 过滤系统的材质为了使微生物限度检查方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体限度检查方法进行验证。
微生物限度检查方法准确与否的核心是对药品抑菌性的有效消除。
常见方法有化学中和法、稀释法和薄膜过滤淋洗法。
6. 程序（PROCEDURE）本公司对无抑菌性的药品采用直接接种法进行方法学验证；具有抑菌性的药品采用薄膜过滤法、培养基稀释法等方法去除抑菌性进行方法验证，若通过验证试验，最终将确认检查条件，批准成为正式检查方法；若不能有效消除抑菌性，将根据具体情况，进行其他抑菌性有效消除的验证试验。
6.1人员要求进行方法验证的人员需有相关无菌知识背景，经过专门的无菌操作及微生物实验室相关的管理规范和操作规程，具有微生物限度检查资格。
6.2 试验环境微生物限度检查应在微生物限度检查室进行，其环境要求为万级区域内局部100级的单向流空气区进行，其中全过程必须严格遵守无菌操作。
试验组加菌液和阳性组操作在负压的菌种鉴定室（阳性实验室）内进行。
6.3 仪器设备及实验器具生化培养箱、霉菌培养箱、脉动真空蒸汽灭菌器、超净工作台、单头过滤系统、0.45μm无菌滤膜、无菌培养皿6.4 培养基及试液6.4.1培养基：均应是通过促生长试验的培养基：(1) 营养肉汤培养基(2) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(3) 营养琼脂培养基(4) 玫瑰红纳培养基6.4.2稀释剂及冲洗液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水溶液、0.9%无菌氯化钠溶液6.5 菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
微生物限度方法学验证开题报告
微生物限度方法学验证开题报告一、研究背景与意义微生物限度检查是评价药品质量的重要指标之一，旨在确保药品在生产和储存过程中不受微生物污染。
然而，在进行微生物限度检查时，存在一些挑战，如微生物的多样性、不同微生物的生理特性以及微生物与药物之间的相互作用等。
因此，进行微生物限度方法学验证对于确保微生物限度检查的准确性和可靠性至关重要。
本研究的目的是建立一套完整的微生物限度方法学验证体系，为药品生产企业、监管机构和科研机构提供指导和支持，以提高我国药品的质量和安全性。
二、研究内容与方法1. 研究内容本研究将围绕以下几个方面展开：(1) 微生物种类的选择与标准菌株的收集；(2) 微生物限度检查方法的建立与优化；(3) 微生物限度检查方法的验证；(4) 验证结果的评估与总结。
2. 研究方法本研究将采用以下研究方法：(1) 文献调研：收集国内外相关文献，了解微生物限度检查方法的研究现状和发展趋势；(2) 实验研究：通过实验探究不同微生物种类、不同药品类型和不同检查方法之间的最佳组合；(3) 数据分析：运用统计分析方法对实验数据进行处理和分析，得出结论；(4) 结果评估：根据验证结果，对微生物限度检查方法的准确性和可靠性进行评价。
3. 技术路线本研究的技术路线如下：选择标准菌株→ 建立检查方法→ 优化检查方法→ 进行方法验证→ 评估验证结果→ 总结与完善。
4. 预期目标本研究的预期目标是建立一套完整的微生物限度方法学验证体系，为药品生产企业和监管机构提供指导和支持，提高我国药品的质量和安全性。
同时，本研究还将为科研机构提供实验依据和数据支持，促进我国微生物限度检查方法的研究和发展。
三、研究计划与时间表1. 研究计划本研究将分为以下几个阶段进行：(1) 准备阶段（X个月）：进行文献调研，确定研究内容和研究方法；(2) 实验阶段（X个月）：进行实验研究，建立和优化微生物限度检查方法；(3) 验证阶段（X个月）：进行方法验证，评估验证结果；(4) 总结阶段（X个月）：总结研究成果，撰写研究报告。
微生物方法学验证
速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。
2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。
（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。
b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。
c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。
d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。
4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。
2022版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程
2022版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌2金黄色葡萄球菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5铜绿假单胞菌6沙门菌（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间）7白色念珠菌8黑曲霉菌（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。
恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天（若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证）五种实验菌分别验证1金黄色葡萄球菌2铜绿假单胞菌3枯草芽孢杆菌4白色念珠菌5黑曲霉菌五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间假设验证一次成功3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间2.控制菌适用性验证：共需要20天大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证：1.方法适用性验证：验证实验共需要30天（若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证）五种实验菌分别验证1金黄色葡萄球菌2大肠埃希菌菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5白色念珠菌6黑曲霉菌6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行假设验证一次成功每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等，方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认。
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
计数 (CFU)
均值 (CFU)
22 26 24
金黄色葡萄 球菌
36 39
38
枯草芽孢杆 菌
62 66
64
铜绿假单胞 菌
58 54
56
生孢梭菌 20 20
20
菌种 计数(CFU) 均值(CFU)
表2 真菌数计数结果 黑曲霉菌
白色念珠菌
86
93
86
83
89
85
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
铜绿假单胞菌
47 50
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
方法： 中国药典相关微生物程度检验法方法验 证试验。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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详细操作方法
菌液制备： (1)取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物 1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌 数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
薄膜过滤：将要求量供试品按薄膜 过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最 终一次冲洗液中逐一加入试验菌少于 100CFU。按要求将培养基直接加至 滤筒内。天天观察并统计结果。
微生物限度检查方法学验证实验
生物安全柜（Biological safety cabinets， BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊 断性标本等具有感染性的实验材料时，用来 保护操作者本人、实验室环境以及实验材料， 使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的 感染性气溶胶和溅出物而设计的。
生物安全柜正广泛用于微生物和生物工程及 其他对操作环境有苛刻要求的场所，目前正 在为医疗卫生、制药、科学研究领域提供无 菌、无尘的可移动的工作环境。
用于微生物限度验证的菌种
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)
菌种的要求：不得超过5代,采用适宜的方法保存。
CMCC (China Medical Culture Collection Center) 中国医学微生物菌种保藏管理中心 B- Bacteria(细菌) F-Fungi(真菌)
(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染,这种 污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可 以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理, 剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微 生物限度检验的对象是不确定的.药品所规定 的项目,除无菌检查,热原具有上述性质,其他 项均无此特征.这一点往往被忽视.污染对药品 而言是一个意外事件.污染批号中的不合格品 是一个随机变量.
结果时 。 定期的验证。
同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。
当建立药品的微生物限度检查方法时，应进 行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证， 以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、 霉菌及酵母菌数的测定。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵 母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对 各试验菌的回收率逐一进行验证。
产单位全面质量管理水平与提高药品质量的 重要措施.
微生物限度检查法及其方法学验证
微生物限度检查法及其方法学验证摘要:本文从四个方面介绍2005版微生物限度检查法增修订内容,重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证,提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证,以增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性.关键词:微生物限度检查法方法学验证微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法,检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查.与2000版相比,2005版微生物限度检查法在以下几方面进行了增修订.一、标准的制订原则:2000版微生物限度法标准细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订,控制菌按给药途径制订.由于同一剂型有不同的给药途径,且随着新剂型的不断出现,按剂型制订标准具有局限性.2005版均按给药途径制订,解决了这一局限性,不会因剂型的改变而带来执行标准的混乱.二、标准的分类:分为三大类,即制剂通则项下规定；口服给药制剂；局部给药制剂,其中化学药部分(二部)包括:1、制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；2、口服给药制剂3、局部给药制剂:眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂.中药部分(一部)包括:1、制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；2、口服给药制剂:不含药材原粉的制剂；含药材原粉的制剂；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂；3、局部给药制剂:用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂；用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂；眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂.三、微生物限度检查方法的增修订:1、明确了环境检测执行的标准和方法,洁净度要求及洁净度定期检查；2、检验量:随机抽取不少于检验量(两个以上最小包装单位)的3倍；贵重、微量样品检验量可酌减；要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml；3、供试液制备:表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物生长和存活无影响；供试液从制备至加入检验用培养基不得过1小时；供试液体积为100ml；非水溶性供试品:增加“十四烷酸异丙酯法”；结肠溶制剂的供试品:用pH为7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解；具抑菌活性的供试品:增加方法的可操作性.4、灭菌:培养基及稀释剂采用验证合格的灭菌程序进行灭菌.5、稀释剂:增加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液、pH 6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH 7.6无菌磷酸盐缓冲液；6、细菌、霉菌及酵母菌计数；7、控制菌检查:新增大肠菌群检查法、梭菌检查法.四、微生物限度检查法的验证:微生物限度检查法验证的目的是确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查.验证的内容包括准确性(回收率)、专属性.验证的类型分为前验证(建立微生物限度检查法时的验证)和再验证(修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证),根据检查方法的不同,又分为细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证.1、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率.验证菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌.菌种要求不得超过5代,菌液制备为50－100cfu/ml.验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组,具体方法如下:1)试验组:平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数.薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数.2)菌液组:测定所加的试验菌数.3)稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化,中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度.试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数.4)供试品对照组:取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数.5)结果判断指标:计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率.A、在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%.B、若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数.C、若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证.2、控制菌检查法的验证试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株.大肠菌群检查用大肠埃希菌；梭菌检查用生孢梭菌.阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌.菌种的要求:不得超过5代.菌液制备为10～100cfu.验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行.验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行.具体如下:1)试验组:取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查.当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中.2)阴性菌对照组:设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性,方法同试验组检出.3)结果判断:阴性菌对照组不得检出阴性对照菌.若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查.试验组未检出试验菌,应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证.我们在审评工作中发现部分制剂本身具有抑菌或杀菌作用,如某些眼用软膏剂,某些含生物碱的中药复方制剂等,所制备的供试液本身具有影响微生物生长的作用,若不经方法学验证,难以保证所采用方法的适合该供试品的微生物限度检查,难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性.以上介绍2005版微生物限度检查法增修订内容,重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证,提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证。
注射用水微生物限度检查方法验证
注射用水微生物限度检查方法验证1.检测方法的准确性验证：首先，应选择适当的注射用水样品，根据检测目标微生物的特性和所需的灵敏度选择合适的培养基和培养条件。
然后，通过添加已知数量的目标微生物到待测样品中，进行平行试验，并重复多次，以评估方法的准确性。
2.检测方法的灵敏度验证：为了确定方法的灵敏度，可以分别添加不同数量的目标微生物到注射用水样品中，然后使用验证方法进行检测。
通过计算检出限和灵敏度等参数，评估方法的灵敏度和可靠性。
3.检测方法的特异性验证：为了验证方法的特异性，可以将不同种类或菌属的微生物添加到注射用水样品中，并使用验证方法进行检测。
通过观察检测结果，评估方法对非目标微生物的反应情况，确定方法的特异性。
4.检测方法的可重复性验证：为了评估方法的可重复性，可以选择不同的操作人员，使用同一批次注射用水样品，采用相同的操作步骤和条件，进行重复性试验。
通过统计分析结果，评估方法的可重复性和一致性。
5.检测方法的应用性验证：6.检测方法的稳定性验证：为了评估方法的稳定性，可以将待测样品在不同的温度和时间条件下进行保存，然后使用验证方法进行检测。
通过比较结果的一致性和可靠性，评估方法的稳定性。
在进行以上验证时，需要确保所有实验人员都经过充分的培训，并严格按照验证方案进行操作。
此外，还应注意样品的收集、保存和处理方法，并进行相应的质量控制措施，以确保验证结果的准确性和可靠性。
总结而言，注射用水微生物限度检查方法的验证是为了评估方法的准确性、灵敏度、特异性、可重复性、应用性和稳定性等指标，以确保检测结果的准确性和可靠性。
这一过程对于保证注射用水的质量和安全性具有重要的意义。
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培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌
的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小 时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍 递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu /ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的验证——结果判断指标 试验组的菌回收率（≥70%） 稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组的菌回收率计算：
（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）÷菌液组×%
稀释剂对照组的菌回收率计算： 稀释剂对照组菌落计数÷菌液组×% 每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养
基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～ 10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或
薄膜过滤。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
• 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～ 100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级 供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100 cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每 株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。
算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。 验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。 置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 供试液不用特殊制备方法 常规法 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌 数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：A） 回收率=(A－B)÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的步骤：
• 根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 • 保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试
验要求。 • 按制定的方法进行试验。 • 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按
验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不 符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证 结果符合设立的验证标准。
微生物限度检查方法的验证
微生物限度检查方法的验证
• 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ——准确性（回收率）
• 控制菌检查法的验证——专属性
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的目的：
确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母 菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、 霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张 膜。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心3～5min， 取上清液，再以3000 r/min离心10～30min，取下面1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液 体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌 量:50～100cfu。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、 中和法、离心沉淀法、联合方法。