生物分离工程实验-实验一

4.2**、 针对A液，除了要测定其下相水溶液中蛋白浓度以外，同时还要测 定上相有机溶剂相中蛋白浓度，测定时可以取1mL混匀的上相溶液，用正辛 烷：正己醇（4:1）的溶液稀释到10mL，并以正辛烷：正己醇（4:1）溶液伟 空白对照，测定上相中的蛋白浓度。
六、注意事项
5、实验过程中一定要记得测定A、B两管的下层水相的体积！ 6、测定吸光值时，注意一定要将溶液装到比色皿高度的2/3左右，不得低
2）原液B （1mg/ml）分别取0.5、1、2、3、4、5ml，用 0.1MKCl的水溶液（pH 7.2）稀释至5ml，配成0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8,、1.0mg/ml的溶液，以稀释液为空白对照， 其他操作同上。
பைடு நூலகம்
五 结果与计算
1、原液A和原液B分别以吸光度值A为纵坐标，牛血清蛋白 量（ mg/ml ）为横坐标作标准曲线图，线性回归，求直线 方程和R2。
2、测吸光度值时，若要进行稀释，则需用相应A原液所用的缓冲液稀释A原 液的水相，用B原液缓冲液稀释B原液的水相。
3、紫外分光光度计：必须使用石英比色皿
4.1、原液A操作中，离心完成后，会形成一种上相油层、中间白色乳浊液层、 下层水相的状态，而且下层水相体积很小，测定该下层溶液光度值时，可以 采用医用针筒抽取出来，并记下其总体积，若针筒长度不够，可以剪去针筒 外端两个突起再吸；然后吸出其水相到干净试管中（注意不要吸入乳浊 液！），并确定其吸出体积， 用0.1MKCl的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释到5ml （计算其稀释倍数），在280nm下测吸光值。
3）KCl ：防止水相乳化，影响萃取物与亲水头部的作用力， 离子浓度越大，萃取率越小。同时影响反胶束的大小。
四、 实验操作
1、萃取：在两只50mL离心管中分别加入10ml原液A和原液B，再分别加 入10ml反胶束相溶液，在旋涡混合器上充分混合5min，达到萃取平衡。
2、离心：离心平衡时，可在离心管中加入少量（根据平衡需要来加） 正辛烷：正己醇溶液调节平衡，然后将乳浊液于4000r/min，离心10min （并使用垂直转子离心机—到一楼和4楼借用，不用角式或水平转子， 否则无法形成完整的萃取层），离心完成后，记下A管和B管下层水相 的体积，注意，涡旋后应立即去离心，不能等待，以免影响萃取结果。
方法 3、以牛血清蛋白为实验对象，了解pH在
反胶束萃取中的重要性。
二、实验原理
1. 反胶束萃取法 利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成的纳米尺度的反胶
束相来萃取水溶液中的蛋白质等生物大分子 。 相对于有机溶剂萃取法，反胶束内部存在水溶液，蛋白质
可以稳定存在，避免与有机溶剂的接触，不易变性失活 注意：反胶束萃取后，蛋白质是被萃取到上相（有机相）
3）注意保护电极，防止损坏或污染。电极不使用时应浸没在饱和氯化钾 溶液中。
8、标准曲线测定吸光值与相应的萃取后下相（水相）吸光值测定一定要 用同一台光度计测定，以消除光度计系统误差。
9、测定下相（水相）吸光值时，一定要取萃取后的清澈的水相，不要混 入浑浊溶液（乳浊液）去测定，负责会导致吸光值偏大而使结果出现负值
（2）但A管（液）下相吸光值测定操作比较特殊，具体见注意事项。
（3） 同时可以测定萃取完毕后，A管和B管中上相的体积和吸光值。， 利于进一步推断萃取效果。
四、 实验操作
4、标准曲线制作
1）原液A（1mg/ml）分别取0.5、1、2、3、4、5ml，用 0.1MKCl的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0）稀释至5ml，配成 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8,、1.0mg/ml的溶液，以稀释液为 空白对照，使用石英比色皿和紫外分光光度计
2、实验报告 实验预习报告包括如下内容： ①实验项目
名称；②详细实验目的、原理；③实验操 作步骤； ④注意事项。 实验报告包括如下内容：①实验项目名称 ；②简写实验目的、原理；③实验结果； ④ 分析与讨论；⑤注意事项等。
实验一 反胶束萃取法 pH对萃取率的影响
一、实验目的
1、加深对反胶束萃取基本原理的理解 2、通过实验，了解反胶束萃取的基本操作
10、一定要记得填写仪器使用记录！
附注：酸度计的使用
1、预热：插入电源，预热30分钟 2、标定:“斜率”旋钮调至100%位置，将电极洗干净，并用滤
纸吸干后将插入中性混合磷酸盐标准缓冲溶液（ 如 pH 6.86/25℃）中，调节“定位”旋钮使指示值为该pH值 3、校正：电极用蒸馏水洗干净，并用滤纸吸干后，放入四硼 酸钠标准缓冲溶液（ 如 pH 9.18/25℃）中，调节“斜率”旋 钮使指示值为该pH值。为保证两点校正的准确性，可以重复 以上步骤。
4、测量pH值：电极蒸馏水洗干净，并用滤纸吸干后，插入 待测溶液中，搅拌使溶液均匀，指示值即是该溶液的pH值。
作业
1、原液A和原液B分别以吸光度值A为纵坐标，牛血清蛋 白量（ mg/ml ）为横坐标作标准曲线图，线性回归，求 直线方程和R2。
2、分别计算不同pH的萃取率，并从理论上分析pH影响 萃取率的原因。
2、将萃取后的两管下相液的吸光度值分别代入原液A和原 液B的标准曲线计算含量
3、蛋白质的萃取率 E=（C0*V0-Cw*Vw）/C0*V0 C0:原液中蛋白质的浓度,V0原液体积，为10mL Cw:萃取平衡后下相液中蛋白质的浓度 Vw:萃取平衡后下相液的体积
六、注意事项
1、每个班前10组同学先做前面的反胶束萃取实验，后面几组同学先做原液A 和原液B的标准曲线。标曲线每4人合做1个。但每组的反胶束萃取A液、B液 都要做。
于此高度，否则会因为光能量漏出，导致实验结果偏小。
7、酸度计（本实验采用精密试纸测定萃取后溶液的pH值）： 1）仪器标定好后，不能再动定位和斜率旋钮，否则必须重新标定。温度
电极与电极应同时插入溶液，自动进行温度补偿。
2）电极插入溶液后要充分搅拌均匀（2~3min），待溶液静止后（2~3min） 再读数。
中去了。 反胶束制备方法：相转移法、注射法、溶解法
2、pH对萃取率的影响
对于蛋白质这种两性物质，当溶液中 pH > pI 时，蛋白质带负电 pH < pI 时,蛋白质带正电 pH = pI 时蛋白质净电荷为0 pH不仅决定蛋白质所带电性，还决定蛋白质净电荷的多少，
pH偏离pI越多，蛋白质净电荷越多 萃取时，必须使蛋白质所带电性与表面活性剂极性基团的电性
3、测定：
1）使用酸度计（或pH试纸）分别测定两管下层水相的pH值
2）使用石英比色皿和紫外分光光度计，测定两管下层水相在280nm波 长下的吸光度值，具体如下：（1）将B液萃取后的上相溶液完全吸出， 并继续吸去上相与下相交融的液体层，然后取清澈的下相0.5ml到干净 试管中，并用0.1MKCl的水溶液稀释到5ml（稀释倍数为10倍），在 280nm下测其吸光值。
3、20mmol/L CTAB(溴代十六烷基三甲铵,阳离子型表面活 性剂，带正电荷。)
4、正辛烷：正己醇（4:1，V/V），与CTAB形成：
CTAB/正辛烷：正己醇反胶束溶液
5、附注：各试剂的作用
1）正辛烷：有机溶剂，种类和极性会影响反胶束的大小
2）正己醇：作为助溶剂，可以使表面活性剂极性分子间的 静电斥力降低，促进反胶束的形成，还增加表面活性剂在有 机相中的溶解度
生物分离工程实验
Bioseparation engineering experiment
王桃云
1、 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录所观察到的现象
和测量的数据。(直接填写到实验报告册的 原始数据栏） 杜绝一切抄袭和弄虚作假现象，一旦发现 后果自负。 做好实验后，一定要填写使用记录。
相反，产生静电引力作用，才能使蛋白质萃取进入反胶束内， 否则不能被萃取。 利用这个原理来测试不同pH条件对蛋白质反胶束萃取的影响。
三、实验试剂
1、原液A（含1mg/ml牛血清蛋白的0.1MKCl的乙酸-乙酸钠 缓冲液）, pH 4.0 （pH < pI=4.9）
2、原液B （含1mg/ml牛血清蛋白的0.1MKCl的水溶液）, pH 7.2 （pH > pI=4.9）
3、分别说明CTAB、正己醇、正辛烷和氯化钾在反胶束 萃取中的作用。