石油降解菌的分离与鉴定

石 油 降解 茵 的分 离 与鉴 定
张 琛 ， 高志 刚， 张 伟 ， 秦 晓， 高 晶， 李德 生 ， 尹 静
（ 天津理工大学 环境科学与安全工程学 院 ， 天津 ３ ０ ８ ） ０ ３４ 摘 要： 按照石 油污染土壤微 生物修 复技 术 目前发展 的方向 ， 本论文针对天 津大港 油田地 区石 油污染盐碱 土壤 的现
１ 材 料 与 方 法
本 项研 究 的实验 材料 与方 法参 考 了文献 ［ ］ 其 ７．
中改进 之处 如下 ．
１ １ 实验材 料 ．
富集 ， 进而危 害人类健康 Ｊ因此 ， ， 土壤 的石油污染 也被 比喻为 “ 化学 定 时炸 弹” ．
石 油污染 土 壤 的修 复 一 般 采 用 物 理 方 法 、 学 化
Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｒ ｌｕ ；ｐ ｔｏｅ ｍ— ｏｌ ｔ ｄ ｓ ｉ；ｐ ｔ ｌ ｕ ｄ ｇ ａ ａｉｎ ｓｒ ｉ ｓ ｓ ｌｔｏ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ：ｐ ｔｏｅ ｍ ｅｒ ｌｕ ｐ ｌ ｅ ｏ ｌ ｅ ｒ ｅ ｍ— ｅ ｒｄ ｔ ｔ ｎ ；ｉ ａｉｎ ａ ｄ ｉ ｅ ｔ ｉａ ｉ ｕ ｏ ｏ ａ ｏ ｆ ｏ
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收稿 日期 ： ０ １０ —６ ２ １ ７ ２ ． 基金 项 目 ：国家 大 学 生 创 新 性 实 验 计 划项 目（ ００ ６ ２ ） １１０ ０ ５ ． 作者简 介：张 琛 （９ ０ １９ 一 ） 女 ， ， 本科． 通讯 作 者 ：尹 静 （９ ７ １６ 一 ） 女 ， 教 授 ， — ｉ：２ ９ ９４ １ ｑ ．ｏｌ ， 副 Ｅｍａ １０ ８ ８８ ＠ ｑ ｃｎ ｌ
基 ，ｂ 为加 入 菌 株 在摇 床 中培 养 ４天 后 的 培养 基 ， （） （） Ｃ 为加 入菌株 并 在摇 床 中培养 ７天 后 的培 养 基 ． 通
过 观察 不难 发 现 ， （ ） （ ） 培 养 基 逐 渐 浑 浊 ， 从 ａ到 Ｃ ， 并
液转入新鲜 的牛 肉膏蛋 白胨液体培养基 中， 在上 述
１０ ｍ ０ Ｌ牛 肉膏蛋 白胨 培 养 基 中 ， ２ 【、６ ／ ｎ 在 ８ｃ １ ０ｒｍｉ 二
别编号为 Ｄ 和 Ｄ Ｆ Ｂ～． 得到 的降解 菌株 降解前 后
石 油 的变化 如 图 １ 图中 （ ） ， ａ 为没 有 加 入 菌株 的培养
条件 下 培养 １— ２天 ． 待培 养 液混 浊后 ， ５ｍ 取 Ｌ培 养
石 油 在人 类 生 产 和 生 活 中扮 演 着 重 要 的 角 色 ，
土 的研 究 时使用 ， 为后 期实 验 提供 可选择 菌种 ．
然 而 由于开 采 技 术 及 运 输 缺 陷 等 原 因 ， 来 越 多 的 越
石 油进 入土 壤 ， 造成 了 比较 严 重 的 土壤 污染 ． 石油 进 入 土壤 后不 仅容 易造成 土 壤板 结 ， 响土壤 肥 力 ， 影 而 且会 影 响植 物 的生长 ， 至 导致 植 物 的死 亡 甚 ； 另 外， 石油 中的有 害物 质 能 通 过 食 物 链 在 动 植 物 体 内
（ ｃｏｌ ｆ ｎ ｉ ｎ ｅｔｌ ｃ ｎｅａ ｄＳｆｔ Ｅ ｇ ｅｒ ｇ Ｔａｊ ｎ ｅｓｙｏ ｅｈ ｏ ｇ ， ｉ ｊ ０ ３４ Ｃ ｉａ Ｓ ｈｏ ｏ ｖｒ ｍ ｎａ Ｓｉ ｃ ｎ ａ ｙ ｎｉ ｅｉ ， ｉｎｉ Ｕ ｉ ｒ ｔ ｆ ｃ ｎｌ ｙ Ｔａ ｉ ３ ０ ８ ， ｈｎ ） Ｅ ｏ ｅ ｅ ｎ ｎ ｎ ｖ ｉ Ｔ ｏ ｎｎ
菌 株筛 选所 使用 的培 养基 包括 牛 肉膏蛋 白胨 液 体 培 养基 ： 肉膏 ５ｇ 蛋 白胨 牛 ，
１ ， ａ １ ， ０ｇ Ｎ Ｃ ｇ 琼脂 １ ， １０ ０ｍｌ ５ ８ｇ 水 ０ ；
方法 和生 物方 法 ， 中生物 修 复具 有 污染 较 少 ， 环 其 对 境产 生 的副作 用小 ， 率高 等特 点 ． 效 因此 也被 誉 为 实 现生 态恢 复 的最有 效措 施 Ｊ为 了 取得 高效 、 底 的 ． 彻 生物 修复 效果 ， 离 和 筛 选 污 染 物 的 高 效 降 解 菌 种 分 成为 生物 修复 的必 然要 求 Ｊ因此 ， 实 验从 大 港 石 ． 本 油污 染 土壤 中提 取 石 油 降解 菌 ， 对 其 进 行 分 离 和 并 鉴定 ， 以备 以后 进 行 植 物 微 生 物 修 复 石 油 污 染 盐 碱
ｇ， Ｃ１ Ｃａ ２・６Ｈ２ ０． ｇ； Ｓ Ｏ ０１ Ｍｇ Ｏ４ ・７Ｈ２ １ ０ ｇ， Ｓ Ｏ ． Ｆｅ Ｏ４
０ ０ ０ １ｇ 石 油 ０ １ｇ ．０ ， ． ．
生 理生 化培 养基 中还 包括
２ １ 年 ８月 ０１
张
琛， ： 等 石油降解菌 的分离 与鉴定
・８ ７・
状， 经过分 离、 筛选、 复筛 ， 从大港油 田的石油 污染土壤 中富集分 离、 选 出 ２株石 油降解 菌， 优 并进 一步研 究了 ２株 菌 的生理生化特性． 菌株鉴 定结果表明 ， 菌株 Ｄ — Ｂ ｌ属于假 单胞杆菌属 ， 菌株 Ｄ Ｆ一１ 于曲霉 菌属 ． 属 关键词 ： 石油 ；石油污染土壤 ； 石油 降解 菌 ； 分离鉴定 中图分类号 ： ５ Ｘ３ 文献标识码 ： Ａ ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １７ －９ Ｘ．０ １ ０ ．２ ｏ ：０３ ６ ／．ｓ ．６ ３ ０５ ２ １ ．４ ０ １ ｓ
主要试 剂还 包括 Ｋ Ｈ Ｏ ， Ｈ Ｃ ， ａＳ ４Ｃ Ｃ２・ ２ Ｐ ４Ｎ ４ ｌＮ ２Ｏ ， ａ １
６ ０， ｅＯ ， Ｈ２ Ｆ Ｓ ４ 石油 ．
２ 实验 结 果
２ １ 筛选 结果 ． 本 实验 从 大港油 田石 油 污染 盐 碱 土 中分 离 得 到
１ ２ 实 验方 法 ．
ｍ ，ａ １ 不 同浓度 加 ， 度 分 别 取 ：％ 、％ 、％ 、 ｌＮ Ｃ 按 浓 Ｏ ３ ７
９ 、 １ ， Ｈ ＝ ７ ７ ％ １％ ｐ ．．
Ｌ Ｂ液体 培养 基 ： 白胨 １ｇ 酵母 浸 出汁 ０ ５ｇ 蛋 ， ． ， Ｎ Ｃ ｇ水 １０ｍ ．Ｈ ＝ ７５，２ Ｃ灭菌 ２ ｉ． ａ１１ ， ０ １ｐ ． １１ｏ ０ｒｎ ａ
牛 肉膏 蛋 白胨 固体 培养 基 ： 肉膏 ５ｇ蛋 白胨 牛 ，
１ ， ａ １ ， １０ ０ ｍ ； ０ｇ Ｎ Ｃ ｇ 水 ０ ｌ ５
石 油 降 解 菌 分 离 筛 选 培 养 基 （ ０ １ ： １００ ｍ ）
Ｋ２ ＰＯ４０． ＮＨ４ ０ ｇ， ２ Ｈ ５ ｇ， Ｃ１１． Ｎａ ＳＯ４２． ０ ｇ，ＫＮ Ｏ３２． ０
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Ｓ ｐｅ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｆｐｅ ｒ ｌ ｕ ｅ ｒ ｄ ｎｇ ｓ ｒ ｉ ｓ ｅ ｒ ｔｏ ｎｄ ｉ ｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｔ ｏ ｅ ｍ ｄ ｇ ａ ｉ ｔ ａ ｎ ｉ
Ｚ Ａ Ｇ Ｃ ｅ ，Ｇ Ｏ Ｚ ｉ ａ ｇ Ｚ Ａ Ｇ Ｗｅ， Ｉ ｉ ， Ａ ｉｇ Ｌ ｅｓｅｇ Ｉ ｉｇ Ｈ Ｎ ｈｎ Ａ ｈ— ｎ ， Ｈ Ｎ ｉ Ｑ Ｎ Ｘａ Ｇ ＯＪｎ ， Ｉ — ｎ ，ＹＮ Ｊ ｇ ｏ Ｄ ｈ ｎ
℃ 、６ ｍｉ 条件 下 培养 １ ． １０ｒ・ ｎ ０ｄ 培养 液 明显 浑浊 ，
图 １ 样 品 （ ） （ ） （ ） 解 前 后 对 比情 况 ａ ， ｂ ，ｅ 降 Ｆｇ １ Ｓ ｍｐｅｃｍｐ ｒｓｎ（ ） Ｉ ） （ ） ｅｏｅａ ｄ ｉ． ａ ｌ ｏ ａｉ ｏ ａ ， ｂ ， ｃ ｂ ｆｒ ｎ
培养 条 件下 连续 转接 重复 富集 培养 ３次 ； （ ） 养 ： 上述 接 种 了 土壤 悬 液 的平 板 倒 置 ， ２培 将 放入 培养 箱 ，７℃培养 １～ ； ３ ２ｄ （） 离 ： ３分 平板 划线 分离 法 ； （ ） 菌 ： 取 典 型 的 细 菌 菌 落 转 接斜 面 培 养 ４挑 选
基中；
且 瓶 中剩余 的石 油 量 在 逐 渐 减 少 ． 明 提 取 出 的 菌 证 株 是可 以有 效 降解石 油 的．
（ ） 筛 ： 小 片无 菌滤 纸放 人 上述 已涂 石 油 的 ５复 将
平 板上 ， 菌 点 在 小 滤 纸 片 上 ， ３ ｃ培养 箱 中倒 挑 置 ７ｃ
置培养 ２ ， ４ｈ后 观察 小 纸片周 围 ， 颜色 变淡 的为石 油 降解 菌 ． ２ 耐 盐碱 石油 降解 真菌 筛选 方法 ） 将 ５ｇ石油 污染 土壤 加入 装有 １０ｍ ０ Ｌ石油 降解 菌筛选 培 养基 的 ２ ０ｍＬ锥 形 瓶 中 ， 入 摇 床 ， ３ ５ 放 在 ０
１２ １ 菌株 筛选 方 法 ． ．
两 株 可 以以石 油 为碳 源 的石 油 降解 菌 ． 据 菌 体形 根
态 及 菌落特 征 初 步判 断 这 两 株 菌 为 真 菌 和 细 菌 ， 分
１ 耐 盐碱 石油 降解 细 菌筛 选方 法 ） （） １ 富集 ： ５ｇ 石 油污 染 过 的 土壤 样 品加 入 将 被
耐盐 性实 验 培 养 基 ： 白胨 ２ ｇ 蒸 馏 水 １０ ０ 蛋 ， ０
各三支， 一支作为空 白对照 ， 其他 两支分别接人两株
供 试菌 ， 同对 照试 管均 放 于 ３ 连 ７℃ 恒温箱 中培养 ２ ４
ｈ 观察 试 管 内培养 液 的混浊程 度 ． ， ２ 生长 曲线 的绘 制 ： ） 采用 比浊 法 ．
第２ ７卷 第 ４期 ２１ ０ １年 ８月
天
津
理
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报
Ｖ０ ． ７ Ｎｏ ４ １２ ． Ａｕ ２０１ ｇ． １
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ Ｉ ０Ｆ Ｔ ＡＮＪ Ｎ Ｉ ＵＮＩ ＶＥＲＳ Ｔ ＯＦ ＴＥＣＨＮｏＬｏＧＹ Ｉ Ｙ
文章 编 号 ：６ ３０ ５ ２ １ ）４ ０ ８ —３ １７ —９ Ｘ（０ １ ０ －０ ６０
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