石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建
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挑取活化好的石油降解菌株一环，点接于血平板 上，#KL 培养 ( N 后若有溶血圈出现，证明该菌能 万方数据
中国土壤与肥料" -//0 （’）
表 !" 菌株的石油降解率及其功能
菌株编号 $% & ’! $% & ,( $% & *! $% & .* $% & 1, $% & !’’ $% & !.’ 石油降解率 （# ） !() * -.) * ,/) / ’0) 1 -) . /) * ’*) ’ 直链烷烃 利用 + + + + & & + 环烷烃 利用 & & & & & & + 芳烃 利用 & & & & + & & 产表面 活性剂 & & & & & + &
降解率 （# ） ’’) 0 ,1) *’) , ,() 0 ,’) 1 */) ! ,’) ( ,1) / ,*) 0 ,*) 1
注： “ + ” 表示能利用， “ & ” 表示不能利用。
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万方数据 — (% —
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： 67 培 养 固 体 培 养 基 加
4& 4& (9 实验所需试剂与仪器 :;< =0> 聚合酶（ 上海生工） 、 7?35@AB; C-D 仪、:@EFE35G HI!/%4 型紫外 J 可见分光光度计、 ,$DI>66 高 速 离 心 机、 I;B?;+ (!%% 型 气 相 色 谱 仪。 4& #9 方法 4& #& 49 石油降解菌株的富集与分离：将 / ) 石油 污染土壤样品加入 4%% 56 培养基"中，#KL 、4/% B M 5?+ 摇床培养 ! N。待培养液混浊后，吸取 / 56 培养液重新转接入新鲜培养基"中，与上述培养条 件相同连续转接富集培养 ( 次。采用稀释平板法进 行分离，将培养液系列稀释后，取 %& 4 56 稀释液 涂布于培养基#中，培养 ’K F；待平板长出菌落后 选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于含油无 机盐固体平板和含油液体培养基中，在两种含油培 养基中均能生长的即为石油降解微生物。 4& #& #9 直链烃降解菌与环烷烃降解菌的筛选 ： 挑取活化好的石油降解菌株一环，接种于 4%% 56 分别含有正十六烷和环己烷的两种选择性液体培养 基中，#KL 、4/% B M 5?+ 摇床培养，装有环己烷的 三角瓶用橡皮塞封口以防止挥发。当培养液明显浑 浊后，再取 4 56 接种到新鲜的 4%% 56 正十六烷和 环己烷选择性培养基中培养，如此重复 ( 次。最后 仍能使培养液变浑浊的即为直链烃或环烷烃降解 菌。 4& #& (9 芳烃降解菌的筛选：采用菲升华法
［ #］ #直链 烃 和 环 烷 烃 降 解 菌 筛 选 用 培 养 基 ： :B& C@) $0 - A， :& BC@) ・ ’B& @ $0 - A， DA*@) ・
8B& @ $0 ’ A， （ 5B) ） & *@) # A ，微量元素溶液 #$ =+，蒸馏水 #$$$ =+， HB 80 $ I 80 & ，碳源为正十 六烷或者环己烷 $0 -1 。 微 量 元 素 溶 液： JK*@) ・ 8B& @ $0 & A， FG*@) ・8B& @$0 - A，.?.E& ’ A，DK*@) ・B& @ $0 $( A， 蒸馏水 #$$$ =+。
" " 随着石油工业的发展，石油在开采和运输的过 程中由于泄漏造成的环境污染日益严重，其中对土 壤的污染尤为严重。我国每年石油污染土壤近 #$ 万 ;，石油污染土地面积约 -$$ 万 <= 。长期的石 油污染不仅破坏了土壤结构使作物减产，而且污染 土壤中低沸点的燃料油类，能引起人体的麻醉、窒 息、化学性肺炎等，其中多环芳烃对人还有致癌、 致突变和致畸等作用；石油污染土壤给生态环境带 来巨大危害的同时，也给国家和社会造成巨大的经 济损失。目前对石油污染的治理方法中，微生物修 复技术被认为是最具有应用前景的修复技术，但是 石油组成成分复杂，其中高分子量的烃类难以降 解，因此，靠一种微生物的降解作用不可能实现石 油污染物的完全降解。目前国内外在石油污染微生 物修复治理方面也有采用混合菌株进行试验研究 的，但大多是将石油降解菌株随机进行组合；本研 究的目的是针对石油中的主要组成成分，筛选了 ’ 株对不同烃类具有降解能力的菌株与一株具有产生 表面活性剂能力的菌株，进行石油降解微生物菌群 的构建及研究，以期在微生物修复中实现微生物菌 群对石油中不同烃类较好的降解。
［ (］
产生表面活性剂。
［ / J !］ 4& #& /9 石油降解率的ຫໍສະໝຸດ Baidu定 ：根据国标 O7(K(K
J KK 规定，采用紫外分光光度法测量石油含量。 4& #& 19 石油降解微生物菌群的构建原则及方法： （ 4 ） 选择具有不同功能和特性菌株进行构建菌群， 使菌群中分别含有直链烃、环烃、芳烃降解菌以及 表面活性剂产生菌株；（ # ） 选择石油降解效果稳 定且石油降解效果较好的菌株构建菌群；（ ( ） 选 择产生表面活性剂性状稳定且生长速度较快的菌株 构建菌群。根据以上原则及方法确定组合方案。 4& #& !9 石油烃组分变化测定：采用气相色谱法， 执行标准为 ,P M :/!!Q J 4QQ/ 《 原油全烃气相色谱 分析方法》 。测试条件：色谱柱为弹性石英毛细柱 (% 5、$I J 4 、内径 %& ## 55；检测器为氢火焰离 子化检测器，温度 (#%L ；汽化室温度 (4%L ，柱 温：/% R (4%L ，速 率 1 L M 5?+；氢 气 为 (% 56 M 5?+，空气为 (%% 56 M 5?+；分流为 (% 56 M 5?+。 4& #& K 9 石 油 降 解 菌 总 =0> 的 提 取： -;A& 03& ,S4#%# H0TU J 4% 柱式细菌基因组 =0> 抽 提试剂盒（ 上海生工） 4& #& Q9 石油降解菌株 41,B=0> 的 C-D 扩增：以总
［ (］
#9 结果与分析 #& 49 分离结果 经过富集培养从胜利油田石油污染土壤样品中 分离到 #(1 株能以石油作为唯一碳源生长的石油降 解细菌。为进一步筛选高效石油降解菌，采用紫外 分光光度计法对石油降解菌株的石油降解能力进行 了测定。表 4 中列出了其中部分用来构建菌群菌株 的除油效果。 #& #9 不同石油烃降解菌株的筛选结果 通过 ( 种不同的选择性培养基分别筛选得到直 链烷烃降解菌 (4 株、环烷烃降解菌 #K 株、芳烃降 — 1Q —
［ &］ $芳烃降解菌筛选用培养基 ： 5B) .E #0 # A， :& BC@) # A， 5?.E $0 - A， :.E $0 & A， DA*@) ・
收稿日期：&$$( , #$ , ’$ 基金项目：国家科技基础条件平台工作项目（ &$$)4:6’$-($ ） 支持。 作者简介：李宝明（ #/8% , ） ，男，辽宁人，博士研究生，从事 微生物资源与利用研究。姜瑞波为通讯作者。
利 用 直 链 烷 烃， 其 石 油 降 解 率 在 * 2 内 达 到 ’*) ’# ；芳烃降解菌中，菌株 $% & 1, 较其它两株 菌利用石油烃能力强且生长迅速。 -) ’" 表面活性剂产生菌的筛选 表面活性剂可以降低油滴表面的张力，使石油 乳化并促进微生物的吸收利用。经过筛选，-’. 株 石油降解菌中有 -, 株菌可以在血平板上形成溶血 圈。其中菌株 $% & !’’ 生长速度快，在血平板上能 形成较大的溶血圈，接种 -, 3 内能迅速使石油乳 化变浑浊，并且连续转接后性状稳定。 -) ," 石油降解微生物菌群的构建 选择上述筛选到的不同烃类降解菌及表面活性 剂产生菌进行组合构建石油降解微生物菌群，组合 方案及实验结果见表 - 。
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#" 材料与方法 #0 #" 材料 #0 #0 #" 实验所需样品：石油污染土壤样品采自胜 利油田油井及炼油厂附近，离地表深度为 #$ >= 左 右，装入无菌袋中密闭保存备用；石油污染水样 采自炼油厂 排 污 口， 装 入 无 菌 瓶 中 密 闭 保 存 备 用。" " #0 #0 &" 实验所需培养基 （ 5B) ） !富集用液体培养基：5?5@’ #0 - A， & *@) #0 - A，:& BC@) # A，DA*@) ・8B& @ $0 - A，:.E $0 A，FG*@) ・ 8B& @ $0 $# A， .?.E& $0 $$& A，蒸 馏 水 #$$$ =+，原油 - A，HB 80 $ 。 "分离培养基为富集用无机盐液体培养基中加 入 &1 琼脂。
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取活化好的石油降解菌株一环，点接于无机盐固体 平板上，然后再把接种后的平板倒扣于底部平铺有 固体菲的 /%% 56 的烧杯上，并用封口膜将接口处 封闭，整体放到沙浴中加热，并在平板上方放上 冰，使菲升华后遇平板 冷 却 而 附 着 其 上，大 约 / 5?+ 后取下平板，#KL 培养 ( N，能产生透明圈的 菌落为芳烃降解菌。 4& #& ’9 表面活性剂产生菌的筛选：由于表面活性 剂具有降低表面张力的作用，可使红细胞破裂并释 放血红素出现溶血圈，因此采用血平板法筛选
中国土壤与肥料" &$$8 （’）
石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建
李宝明，阮志勇，姜瑞波
（ 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ! 中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京" #$$$%# ）
摘" 要：从胜利油田石油污染土壤中富集、分离得到 &’( 株能以石油作为唯一碳源和能源的石油降解菌株；采 用选择性培养基进行复筛得到直链烷烃降解菌 ’# 株、环烷烃降解菌 &% 株、芳烃降解菌 ’ 株以及表面活性剂产生 菌 &) 株；从 ’ 种不同烃类降解菌和表面活性剂产生菌中选择菌株，构建石油降解微生物菌群，结果表明，由菌 株 *+ , -# 、*+ , %) 、*+ , #’’ 和 *+ , #(’ 组成的菌群 ./ 降解石油能力最强，菌群 ./ 在含原油浓度为 $0 -1 的无 机盐培养液中，- 2 内原油的降解率达到了 --0 -1 ；气相色谱分析结果证明，菌群 ./ 能有效降解原油中的饱和 烃和芳烃组分；通过 #(*3456 序列分析，初步鉴定 *+ , -# 和 *+ , #(’ 属于红球菌属（ !"#$#%#%%&’ ’((0 ） ， *+ , %) 、*+ , #’’ 两株菌分别属于苍白杆菌属（ )%"*#+,%-*&. ’(0 ） 、铜绿假单胞菌属（ /’0&$#.#1,’ ’(2 ） 。 关键词：石油；降解菌；菌群构建；鉴定 中图分类号：7#8&" " " 文献标识码：9" " " 文章编号：#(8’ , (&-8 （ &$$8 ） $’ , $$(% , $-
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挑取活化好的石油降解菌株一环，点接于血平板 上，#KL 培养 ( N 后若有溶血圈出现，证明该菌能 万方数据
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表 !" 菌株的石油降解率及其功能
菌株编号 $% & ’! $% & ,( $% & *! $% & .* $% & 1, $% & !’’ $% & !.’ 石油降解率 （# ） !() * -.) * ,/) / ’0) 1 -) . /) * ’*) ’ 直链烷烃 利用 + + + + & & + 环烷烃 利用 & & & & & & + 芳烃 利用 & & & & + & & 产表面 活性剂 & & & & & + &
降解率 （# ） ’’) 0 ,1) *’) , ,() 0 ,’) 1 */) ! ,’) ( ,1) / ,*) 0 ,*) 1
注： “ + ” 表示能利用， “ & ” 表示不能利用。
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： 67 培 养 固 体 培 养 基 加
4& 4& (9 实验所需试剂与仪器 :;< =0> 聚合酶（ 上海生工） 、 7?35@AB; C-D 仪、:@EFE35G HI!/%4 型紫外 J 可见分光光度计、 ,$DI>66 高 速 离 心 机、 I;B?;+ (!%% 型 气 相 色 谱 仪。 4& #9 方法 4& #& 49 石油降解菌株的富集与分离：将 / ) 石油 污染土壤样品加入 4%% 56 培养基"中，#KL 、4/% B M 5?+ 摇床培养 ! N。待培养液混浊后，吸取 / 56 培养液重新转接入新鲜培养基"中，与上述培养条 件相同连续转接富集培养 ( 次。采用稀释平板法进 行分离，将培养液系列稀释后，取 %& 4 56 稀释液 涂布于培养基#中，培养 ’K F；待平板长出菌落后 选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于含油无 机盐固体平板和含油液体培养基中，在两种含油培 养基中均能生长的即为石油降解微生物。 4& #& #9 直链烃降解菌与环烷烃降解菌的筛选 ： 挑取活化好的石油降解菌株一环，接种于 4%% 56 分别含有正十六烷和环己烷的两种选择性液体培养 基中，#KL 、4/% B M 5?+ 摇床培养，装有环己烷的 三角瓶用橡皮塞封口以防止挥发。当培养液明显浑 浊后，再取 4 56 接种到新鲜的 4%% 56 正十六烷和 环己烷选择性培养基中培养，如此重复 ( 次。最后 仍能使培养液变浑浊的即为直链烃或环烷烃降解 菌。 4& #& (9 芳烃降解菌的筛选：采用菲升华法
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" " 随着石油工业的发展，石油在开采和运输的过 程中由于泄漏造成的环境污染日益严重，其中对土 壤的污染尤为严重。我国每年石油污染土壤近 #$ 万 ;，石油污染土地面积约 -$$ 万 <= 。长期的石 油污染不仅破坏了土壤结构使作物减产，而且污染 土壤中低沸点的燃料油类，能引起人体的麻醉、窒 息、化学性肺炎等，其中多环芳烃对人还有致癌、 致突变和致畸等作用；石油污染土壤给生态环境带 来巨大危害的同时，也给国家和社会造成巨大的经 济损失。目前对石油污染的治理方法中，微生物修 复技术被认为是最具有应用前景的修复技术，但是 石油组成成分复杂，其中高分子量的烃类难以降 解，因此，靠一种微生物的降解作用不可能实现石 油污染物的完全降解。目前国内外在石油污染微生 物修复治理方面也有采用混合菌株进行试验研究 的，但大多是将石油降解菌株随机进行组合；本研 究的目的是针对石油中的主要组成成分，筛选了 ’ 株对不同烃类具有降解能力的菌株与一株具有产生 表面活性剂能力的菌株，进行石油降解微生物菌群 的构建及研究，以期在微生物修复中实现微生物菌 群对石油中不同烃类较好的降解。
［ (］
产生表面活性剂。
［ / J !］ 4& #& /9 石油降解率的ຫໍສະໝຸດ Baidu定 ：根据国标 O7(K(K
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#9 结果与分析 #& 49 分离结果 经过富集培养从胜利油田石油污染土壤样品中 分离到 #(1 株能以石油作为唯一碳源生长的石油降 解细菌。为进一步筛选高效石油降解菌，采用紫外 分光光度计法对石油降解菌株的石油降解能力进行 了测定。表 4 中列出了其中部分用来构建菌群菌株 的除油效果。 #& #9 不同石油烃降解菌株的筛选结果 通过 ( 种不同的选择性培养基分别筛选得到直 链烷烃降解菌 (4 株、环烷烃降解菌 #K 株、芳烃降 — 1Q —
［ &］ $芳烃降解菌筛选用培养基 ： 5B) .E #0 # A， :& BC@) # A， 5?.E $0 - A， :.E $0 & A， DA*@) ・
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利 用 直 链 烷 烃， 其 石 油 降 解 率 在 * 2 内 达 到 ’*) ’# ；芳烃降解菌中，菌株 $% & 1, 较其它两株 菌利用石油烃能力强且生长迅速。 -) ’" 表面活性剂产生菌的筛选 表面活性剂可以降低油滴表面的张力，使石油 乳化并促进微生物的吸收利用。经过筛选，-’. 株 石油降解菌中有 -, 株菌可以在血平板上形成溶血 圈。其中菌株 $% & !’’ 生长速度快，在血平板上能 形成较大的溶血圈，接种 -, 3 内能迅速使石油乳 化变浑浊，并且连续转接后性状稳定。 -) ," 石油降解微生物菌群的构建 选择上述筛选到的不同烃类降解菌及表面活性 剂产生菌进行组合构建石油降解微生物菌群，组合 方案及实验结果见表 - 。
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#" 材料与方法 #0 #" 材料 #0 #0 #" 实验所需样品：石油污染土壤样品采自胜 利油田油井及炼油厂附近，离地表深度为 #$ >= 左 右，装入无菌袋中密闭保存备用；石油污染水样 采自炼油厂 排 污 口， 装 入 无 菌 瓶 中 密 闭 保 存 备 用。" " #0 #0 &" 实验所需培养基 （ 5B) ） !富集用液体培养基：5?5@’ #0 - A， & *@) #0 - A，:& BC@) # A，DA*@) ・8B& @ $0 - A，:.E $0 A，FG*@) ・ 8B& @ $0 $# A， .?.E& $0 $$& A，蒸 馏 水 #$$$ =+，原油 - A，HB 80 $ 。 "分离培养基为富集用无机盐液体培养基中加 入 &1 琼脂。
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石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建
李宝明，阮志勇，姜瑞波
（ 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ! 中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京" #$$$%# ）
摘" 要：从胜利油田石油污染土壤中富集、分离得到 &’( 株能以石油作为唯一碳源和能源的石油降解菌株；采 用选择性培养基进行复筛得到直链烷烃降解菌 ’# 株、环烷烃降解菌 &% 株、芳烃降解菌 ’ 株以及表面活性剂产生 菌 &) 株；从 ’ 种不同烃类降解菌和表面活性剂产生菌中选择菌株，构建石油降解微生物菌群，结果表明，由菌 株 *+ , -# 、*+ , %) 、*+ , #’’ 和 *+ , #(’ 组成的菌群 ./ 降解石油能力最强，菌群 ./ 在含原油浓度为 $0 -1 的无 机盐培养液中，- 2 内原油的降解率达到了 --0 -1 ；气相色谱分析结果证明，菌群 ./ 能有效降解原油中的饱和 烃和芳烃组分；通过 #(*3456 序列分析，初步鉴定 *+ , -# 和 *+ , #(’ 属于红球菌属（ !"#$#%#%%&’ ’((0 ） ， *+ , %) 、*+ , #’’ 两株菌分别属于苍白杆菌属（ )%"*#+,%-*&. ’(0 ） 、铜绿假单胞菌属（ /’0&$#.#1,’ ’(2 ） 。 关键词：石油；降解菌；菌群构建；鉴定 中图分类号：7#8&" " " 文献标识码：9" " " 文章编号：#(8’ , (&-8 （ &$$8 ） $’ , $$(% , $-