新冠核酸检测结果分析、报告与解释(新冠肺炎核酸检测学习专家课堂)

新冠核酸检测结果分析、报告与解释

新型冠状病毒

u2020.1.12.WHO将2019年底新发现的冠状病毒暂时命名为新型冠状病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）

u 2020.2.11.国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（sever acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）

u 2020.2.11.WHO将SARS-CoV-2引起的疾病称为2019冠状病毒病（coronavirus disease 19, COVID-19）

u SARS-CoV-2是新发现的可感染人类的冠状病毒

u属于套式病毒目、冠状病毒科、β-冠状病毒属

u为单股正链有包膜的RNA病毒

u呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60~140nm。外膜有蘑菇状蛋白刺突，使病毒形如王冠状

u其基因组大约由29000个核苷酸组成

u其基因组序列与蝙蝠SARS样冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21株序列同源性85%以上，S刺突蛋白含SARS-CoV相似的受体结合结构域

u与2003年引起SARS的SARS-CoV同源性79.5%

u采用β-CoV基因组中一个互补回文序列进行分析，发现SARS-CoV-2可能

来自菊头蝠（Rhinolophus）

SARS-CoV-2的基因组结构特点

u SARS-CoV-2基因组有12个开放读码框（ORF），包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14

u ORF 1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因（RdRp）所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制

u S区编码刺突蛋白，与病毒感染能力相关，通过与细胞表面血管紧张素转换酶2受体结合进入宿主细胞

u E区编码囊膜蛋白，负责病毒包膜及病毒颗粒的形成

u M区编码膜蛋白

u N区编码核壳蛋白，与病毒基因组宿主RNA互相识别

u由于SARS-CoV-2的1ab基因区的RdRp基因在进化树上与SARS-CoV的RdRp基因显著不同，故被列为一种全新的β属冠状病毒。因此，RdRp基因也成为鉴定SARS-CoV-2的重要标志物。

SARS-CoV-2的核酸检测方法

u实时荧光逆转录PCR法（qRT-PCR）：目前最常用的实验室诊 断SARS-CoV-2感染的方法（17个）

u恒温扩增：即时检测（POCT）（4个）

u基因测序：将测序结果与已知的SARS-CoV-2序列做同源性比对（1个）u 杂交捕获法：1个

u 已有23个获NMPA批准的新冠核酸检测试剂（截至7.13）

qRT-PCR法检测SARS-CoV-2

u 检测原理：根据SARS-CoV-2基因序列设计引物和TaqMan探针，采用实时逆转录多重RT-PCR法扩增SARS-CoV-2基因和内标基因（常用RNase P基因，非竞争性内标），定性检测样本是否存在SARS-CoV-2。

u靶标基因：1、2、3个不等，常为2个靶标。

u核酸提取和扩增：根据所用试剂的说明书操作。样本保存液、核酸提取试剂应与核酸扩增试剂配套。有些核酸提取试剂易受胍盐或保存液中特殊成分的影响，影响核酸提取效果。

u质控样本：试剂空白、阴性、弱阳性、阳性质控样本

扩增仪参数设置

u 以ABI Prism 7500和达安基因股份有限公司双靶标检测试剂为例

u 在荧光定量PCR仪上设置参数：

u设置探针检测模式：Reporter1：FAM（N基因），Quencher 1：NONE；

Reporter 2：VIC（ORF1ab基因），Quencher 2：NONE； Reporter3：Cy5（内标基因），Quencher3：NONE；Passive Reference：NONE

u设置样本检测位置：打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控品（NTC）、阳性质控品以及未知样本（Unknown），并在“Sample

Name”一栏中设置样本号

u设置扩增条件：打开“instrument”窗口，根据试剂盒说明书设置循环条件

PCR循环条件的设置

设置完成后，保存文件（年月日+项目+批次），运行程序。

扩增结果分析流程

u扩增结束后保存结果

u将原始扩增曲线由对数图谱转换为线性图谱，对每个检测基因（ORF1ab、N、内标）分别进行分析，分别调节其基线和阈值，点击Analysis获得分析结果

u 先分析质控样本结果，再分析临床样本结果

u 应分析每个样本的所有扩增曲线

u 在“Report”窗口读取检测结果

结果判断标准

u 阳性判断标准：ORF1ab和N基因Ct值≤40，且有明显的S型扩增曲线u阴性判断标准：ORF1ab和N基因无扩增曲线或Ct值＞40，且内对照有扩增曲线

u可疑判断标准：ORF1ab和N区，仅有其中一个Ct值≤40，且有明显的S型扩增曲线

u复检规则：

l对于检测结果可疑的样本，进行复检。若复检结果一致，判断样品为新型冠状病毒阳性；若复检均为阴性，判断为未检测到新型冠状病毒RNA。

l靶基因和内标均无扩增曲线，进行复检。

l阳性样本采用第二种试剂复检，或用灵敏度更高的试剂或方法复检。

基线（baseline）：产物积累的荧光信号能被仪器检测到的最下限。

循环阈值(cycle threshold, C T)