特定基因表达水平的检测

特定基因表达水平的检测（试剂制备、操作步骤和注意事项）2010-01-10 23:19:59 来源：易生物实验浏览次数：192 网友评论0 条

Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA 或RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。

关键词：基因表达

RNA -gel blot analysis 或Northern Blot

继分析DNA 的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA 或含poly A尾的RNA 样品中特定mRNA 分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA 最为常用的经典方法。

与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA 或RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RN A 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。但与Southern杂交不同的是，总R NA 不需要进行酶切，即是以各个RNA 分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA 水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然North ern也可检测目标mRNA 分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。

一、试剂准备（易生物试剂购销平台/yp/product-list-43.html）

1、0.5M EDTA: EDTA16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。

2、50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜，高压灭菌。

3、5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS[3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH调pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。

4、20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH 至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。

5、6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。

6、50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2 O至50ml,无菌抽滤、分装。

7、1M Na2HPO4: Na2HPO4•12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。

8、1M NaH2PO4: NaH2PO4•2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。

9、0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml 。

10、STE缓冲液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。

11、预杂交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH 6.6）,10%SDS1ml, 总体积20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4μl/ml。

12、DEPC H2O: 1000mldd H2O中加入DEPC 1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。

二、操作步骤

1、总RNA 提取：见相关内容。

2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。

3、样品制备：取总RNA 4.5μl(约20-30μg) ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。

4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA 的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。

特定基因表达水平的检测（试剂制备、操作步骤和注意事项）2010-01-10 23:19:59 来源：易生物实验浏览次数：193 网友评论0 条

Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA 或RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。

关键词：基因表达

5、将RNA 从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：

（1）用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。

（2）将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。（3）用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。（4）在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。