基因表达检测RTPCR
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用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少， 可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译 和分子克隆等。
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16
RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿 3. 异丙醇（RNA专用） 4. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass
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18
操作步骤（二）
4. 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟；
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12
RNA EXTRACTION (mini prep)
RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调 节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对 于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生 物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键 的因素是尽量减少RNA酶的污染。
6. 180－300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活 RNA酶的商品化产品处理塑料制品；
7. 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等；
8. 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶
的活性。
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8
防止内源RNA酶降解RNA
材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步
基因表达水平
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PCR
•Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.
2
（梁大成等，2006）
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3
表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析
ladder
EI12I1
AB
C
D
E
c13 57 c 13 57 c 13 57 c 13 57c 13 57
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7
防止外源RNase污染的主要措施(二）：
5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻 璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品 使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话， 用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在 15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。
氧钒核糖核苷复合物:
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3 O
能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百
地抑制RNA酶的活性
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11
RNA酶蛋白质抑制剂 Ribonuclease Inhibitor
可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。 不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。
A: IRBB10 叶片接种 白叶枯（PXO86）
EI22F22
B: IRBB13 叶片接 种 白叶枯（PXO99）
EI1K8 EI35I3 ß-actin
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C: C101A51 叶接种 稻瘟病（V86013）
D: MH63 叶片接种 稻瘟病（V86013）
E: MH63 叶片接种 稻瘟病（1366）
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13
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
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14
提取方法：
➢ 苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤 其是对多酚等含量高的材料不适
➢ 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 ➢ 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
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15Hale Waihona Puke Baidu
利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中， 能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水 相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
第三部分： 基因表达检测
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
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1
基因表达分析
Northern Blotting
Reverse Transcription PCR
RNA抽提
反转录
基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导
cDNA
Northern Blotting
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9
RNA酶抑制剂
RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA 分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的 完整性。用来使RNA酶不发挥作用的 RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC 2. 氧钒核糖核苷复合物 3. RNA酶的蛋白质抑制剂
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10
DEPC:
是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧 基甲酸化形式破坏RNase的活性
外源RNase的主要来源：
被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等
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6
防止外源RNase污染的主要措施(一）：
1. 当处理RNA时，移液器专用
2. 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液 等留出专用；
3. 溶液和试剂分装成小份保存；
4. RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的 水冲洗）；
（周斌，2001，硕士论文） 4
实验原理
mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板 进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交 更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便， 它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方 法。
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5
RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染
bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 5. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs 以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一 次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。
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17
操作步骤（一）
• 液氮磨样，每管分装0.1克样品； • 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积
的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于 冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体 的解离； 1. 加200 µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟 左右；
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RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿 3. 异丙醇（RNA专用） 4. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass
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操作步骤（二）
4. 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟；
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RNA EXTRACTION (mini prep)
RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调 节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对 于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生 物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键 的因素是尽量减少RNA酶的污染。
6. 180－300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活 RNA酶的商品化产品处理塑料制品；
7. 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等；
8. 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶
的活性。
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防止内源RNA酶降解RNA
材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步
基因表达水平
可编辑ppt
PCR
•Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.
2
（梁大成等，2006）
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表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析
ladder
EI12I1
AB
C
D
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c13 57 c 13 57 c 13 57 c 13 57c 13 57
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防止外源RNase污染的主要措施(二）：
5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻 璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品 使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话， 用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在 15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。
氧钒核糖核苷复合物:
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3 O
能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百
地抑制RNA酶的活性
可编辑ppt
11
RNA酶蛋白质抑制剂 Ribonuclease Inhibitor
可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。 不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。
A: IRBB10 叶片接种 白叶枯（PXO86）
EI22F22
B: IRBB13 叶片接 种 白叶枯（PXO99）
EI1K8 EI35I3 ß-actin
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C: C101A51 叶接种 稻瘟病（V86013）
D: MH63 叶片接种 稻瘟病（V86013）
E: MH63 叶片接种 稻瘟病（1366）
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实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
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提取方法：
➢ 苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤 其是对多酚等含量高的材料不适
➢ 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 ➢ 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
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15Hale Waihona Puke Baidu
利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中， 能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水 相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
第三部分： 基因表达检测
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
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基因表达分析
Northern Blotting
Reverse Transcription PCR
RNA抽提
反转录
基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导
cDNA
Northern Blotting
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9
RNA酶抑制剂
RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA 分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的 完整性。用来使RNA酶不发挥作用的 RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC 2. 氧钒核糖核苷复合物 3. RNA酶的蛋白质抑制剂
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DEPC:
是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧 基甲酸化形式破坏RNase的活性
外源RNase的主要来源：
被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等
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6
防止外源RNase污染的主要措施(一）：
1. 当处理RNA时，移液器专用
2. 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液 等留出专用；
3. 溶液和试剂分装成小份保存；
4. RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的 水冲洗）；
（周斌，2001，硕士论文） 4
实验原理
mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板 进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交 更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便， 它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方 法。
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RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染
bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 5. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs 以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一 次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。
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操作步骤（一）
• 液氮磨样，每管分装0.1克样品； • 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积
的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于 冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体 的解离； 1. 加200 µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟 左右；