基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤

基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤

1 材料（试剂和耗材）

1.1 样本（小鼠组织）-2个

1.2 引物（life technology公司合成）

1.3 Bestar TM qPCR RT Kit（德国DBI货号：DBI-2220）

1.4 Bestar® SybrGreenqPCRmastermix（德国DBI货号：DBI-2043）

1.5 96孔板（美国life technology）

2 材料（仪器）

2.1 ABI7500荧光定量PCR仪（life technology公司）

2.2 TGL-16M低温冷冻离心机（湘仪）

2.3 SW-CJ-1D单人净化工作台（泸净净化）

2.4 HR40-ⅡA2生物安全柜（Haier）

3 实验步骤

3.1 RNA的抽提

RNA 的提取按life technology公司提供的Triozol RNA提取试剂盒的使用说明进行。程序如下：

（1）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol；

（2）加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s（请勿涡漩激烈振荡），室温静置3min，12,000g，4℃离心15min，置于冰上；

（3）溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取500μl水相至另一个新的RNase free的EP管中；

（4）加入500μl异丙醇，-20度放置1h，12,000g，4℃离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清；

1

（5）加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；

（6）超净工作台上吹干样品10min，加入适量DEPC水溶解RNA。加入40μl DEPC 水溶解沉淀。

3.2 RNA质量检测

紫外分光光度计测定RNA浓度：

3.3去基因组DNA和cDNA的合成

将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。

把RNA在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。

逆转录反应：

5×RT Buffer 2μL

RT Enzyme Mix 0.5μL

Primer Mix 0.5μL

RNA 6μL

RNase-free Water 1μL

Toal10μL 反应条件：

37°C, 15min

98°C, 5min

4°C,hold

反应结束后，-20°C保存。

3.4cDNA 的实时荧光定量PCR 3.

4.1实验步骤

每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR 反应体系为20μL ，根据表1.配置。反应条件为：

95°C2min 95°C10s

60°C34s （采集荧光信号） 72°C 30s

循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。

3.4.2实验结果的分析方法

本实验采用2-△△Ct 法进行分析，计算公式为：

）]

平均C t 值

对照组管家基因 - 平均C t 值对照组目的基因（ - ） 平均C t 值基因

待测组 - 平均C t 值待测组目的基因[（管家-=2

F

F 为相对表达量，根据此次试验的设计，对照组中的目的基因表达量为1。

45个循环

4结果

4.1 扩增曲线

4.2 熔解曲线

GAPDH 基因熔解曲线

x 基因熔解曲线

y 基因熔解曲线-2

4.3实验数据

见EXCEL 表格。

备注：∆Ct =目的基因Ct - 管家基因Ct ； ∆∆Ct =待测样品∆Ct - 对照样品∆Ct ； 2-∆∆Ct =相对表达量。

4.4 柱形图

0.00

0.501.001.502.002.50G 对B

G3B

x

2^(-△△Ct)

广州辉骏生物科技有限公司

0.00

0.200.400.600.801.001.20G 对B

G1B

y

2^(-△△Ct)