生物技术及生物化工专业综合技能培训手册正文

第一篇：菌种相关技能技能一显微技术实验操作一、显微技术的应用：1.鉴定菌种形态，初步鉴定菌种种类；2.在微生物生产、科研工作中对操作的可靠性进行检测，如是否染菌。

二、实验目的：掌握实验室显微镜的使用方法，能够根据实验需要运用各种染色方法进行鉴定。

三、学习重点：观测样品的制备光学显微镜的使用常用染液的制备单染色法和革兰氏染色四、使用仪器超净工作台、载玻片（若干），去离子水，移液枪，灭菌枪头，接种环五、试剂结晶紫、酒精、草酸铵、蒸馏水（或去离子水）、碘、碘化钾、番红六、染色液配制结晶紫染色液：溶液A 结晶紫2.5g、酒精（95%）25.0ml溶液B 草酸铵1.0g、蒸馏水100.0ml将结晶紫研细后，加入95%乙醇使之溶解，配成A液；将草酸铵溶于蒸馏水配成B液，两液混合后即成。

卢哥氏碘液：碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0g。

先将碘化钾溶解在一小部分的蒸馏水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，然后加入其余的蒸馏水即成。

番红染液：番红2.0g、蒸馏水100.0ml。

七、染色步骤：（1）革兰氏染色法：涂片——干燥——固定（不能在火焰上烤）——染色（结晶紫1min）——水洗——镜检如果省去固定步骤，菌体的芽孢、荚膜一般都能看到（2）细菌的单染色法涂片——干燥——固定初染（结晶紫1滴，约1min）——水洗媒染（滴加碘液，覆盖1min）——水洗脱色（用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止）——水洗复染（用番红液染1-2min）——水洗镜检（干燥后，置油镜观察）阴性呈红色，阳性呈紫色。

以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

技能二PH计的使用一、实验目的:掌握PH计的标定方法(一点标定法、两点标定法)并学会不同PH标准缓冲液溶液的配制。

二、实验原理:PH计是利用PH复合电极对被测溶液中不同的PH值产生的直流电位,通过PH前置放大器和测温传感器对被测溶液的温度测量信号叠加,并进行自动运算后输入到转换器,以达到PH 值的数字显示。

PH计经过标准缓冲液校准后，即可测量溶液的PH值。

三、仪器PHS-3B精密级数字式酸度计100ml小烧杯三只玻璃棒洗瓶250ml容量瓶三只温度计一只四、试剂邻苯二甲酸氢钾、混合磷酸盐、四硼酸钠、去离子水标准PH缓冲液的配制1、PH 4.0邻苯二甲酸盐缓冲液取邻苯二甲酸氢钾一小袋，溶解后用250ml容量瓶定溶到250ml即可2、PH 6.86混合磷酸盐取混合磷酸盐一小袋，溶解定容到250ml即可3、PH 9.18四硼酸钠取四硼酸钠一小袋，溶解定容到250ml即可五、实验步骤仪器的预热〈1〉接通电源，把开关置于“开”的位置，预热10分钟。

〈2〉温度补偿方法自动温度补偿法将仪器后侧的“选择开关”置于自动，把仪器的“PH-T-mV”置于“T”，数字显示即为测温传感器测得的温度，同时仪器将温度信号送入PH-T混合电路进行运算，从而起到PH自动补偿的目的。

手动温度补偿法拔去温度传感器，将仪器后侧的“选择开关”置于手动。

把仪器的“PH-T-mV”置于“T”，调节温度调节旋钮，使数字显示值与温度计显示数值相同，仪器将该温度信号送入PH-T混合电路进行运算，从而起到PH自动补偿的目的。

仪器的标定<1>一点标定法：以手动温度补偿为例用去离子水清洗电极并用滤纸吸干，然后插入标准缓冲液中（PH=4.00或PH=9.18），将“PH-T-mV”旋钮置于“T”，调节温度旋钮使显示温度和标准液温度相同。

将“PH-T-mV”旋钮置于“PH”，“斜率”旋钮顺时针旋足，调节“定位器”旋钮，使显示器数值和标准缓冲液在该温度下PH值（PH=4.00或PH=9.18）注：仪器一点标定结束后，此时“定位”旋钮不再变动。

〈2〉两点标定法：以手动温度补偿为例用去离子水清洗电极并用滤纸吸干，然后插入PH=6.86标准缓冲液中，将“PH-T-mV”旋钮置于“T”，调节温度旋钮使显示温度和标准液温度相同。

将“PH-T-mV”旋钮置于“PH”，数字显示值为PH=7.0的标准缓冲溶液标准值。

a)如果测量的缓冲溶液为酸性，将电极从PH=6.86缓冲溶液中取出，用去离子水清洗，再用滤纸吸干，然后插入PH=4.00标准缓冲液中，调节“斜率”旋钮，使数字显示值为该温度下PH=4.00缓冲液标准值。

b) 如果测量的缓冲溶液为碱性，将电极从PH=6.86缓冲溶液中取出，用去离子水清洗，再用滤纸吸干，然后插入PH=9.18标准缓冲液中，调节“斜率”旋钮，使数字显示值为该温度下PH=9.18缓冲液标准值。

注：经校准“定位”旋钮和“斜率”旋钮的仪器，即可用来测量溶液PH值。

此时“定位”旋钮和“斜率”旋钮不再变动。

如果连续使用时，每天标定一次就可以了。

常规测量可采用一点标定法，精确测量采用两点标定法。

技能三培养基的配制一、实验目的1 掌握不同培养基的配制方法2 了解不同培养基的性能、应用范围二、实验试剂蛋白胨酵母膏酵母粉NaCl MgSO4 (NH4)2SO4 KH2PO4 甘油脱脂奶粉（光明）琼脂1mol/L NaOH 1mol/L HCl三、实验仪器PH计烧杯玻璃棒胶头滴管四、实验步骤MLB培养基（g/L）蛋白胨10.0 酵母膏 5.0 NaCl 5.0 MgSO4 0.4 PH=7.01/2MLB培养基（g/L）蛋白胨10.0 酵母膏 5.0 NaCl 5.0 MgSO4 0.4 PH=7.0准确称取各种药品，用1000ml 自来水溶解，然后用1mol/L NaOH 在PH计的测量下进行PH的调整。

如果需要配制固体培养基，在上述调好PH基础上按18g/L量加入琼脂混合均匀即可。

SMA培养基（g/L）蛋白胨 5.0 酵母粉 3.0 脱脂奶粉12 琼脂18 PH=7.5准确称取各种药品，把蛋白胨、酵母粉用500ml水溶解，脱脂奶粉也用500ml水溶解，然后用1mol/L NaOH 在PH计的测量下进行PH的调整。

将调好PH的蛋白胨、酵母粉和琼脂混合均匀。

注：将调好PH的蛋白胨、酵母粉和琼脂混合液与脱脂奶粉分别分装灭菌，使用时两者混合均匀后倒平板。

基础培养基（g/L）蛋白胨10.0 (NH4)2SO4 1.0 KH2PO4 0.5 MgSO4 0.3 NaCl 1.0 甘油5ml/L准确称取各种药品，用1000ml 自来水溶解，然后用1mol/L NaOH 在PH计的测量下进行PH的调整。

最后将配制好的培养基进行灭菌，烘干水分。

液体培养基主要用来进行微生物的培养，固体培养基主要用来进行菌种保藏、纯化。

其中SMA固体培养基主要用来进行高产酶菌的筛选。

技能四灭菌操作一、实验目的掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法二、实验器料根据实验需要确定，常见的有：培养皿试管锥形瓶枪头三、实验原理为确保实验顺利进行，要求把实验所用的玻璃器皿清洗干净。

为保持灭菌后的无菌状态，需要对培养皿、试管等进行包扎，对试管和锥形瓶等加塞棉塞。

这些工作须严格进行操作，但如果操作不当或不按操作规定进行，则会影响实验结果，甚至导致实验失败。

灭菌是指杀死一定环境的所有微生物。

微生物实验室常用的灭菌方法包括：直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌等。

基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质变性，从而达到杀菌目的。

四、实验步骤1 器皿洗涤（1）不能用有腐蚀作用的化学试剂和硬度比玻璃大的物品来洗涤擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，然后冲洗干净。

（2）用过的器皿应立即洗涤。

（3）含有琼脂培养基的器皿，先将培养基刮到废液缸里，然后清洗。

含有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。

（4）一般器皿可用洗涤剂进行清洗，然后再用清水冲洗干净。

洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。

2 器皿包扎（1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（根据需要而定）叠加在一起，用报纸或牛皮纸包好，然后进行灭菌。

（2）试管和锥形瓶：试管应用棉塞塞好，六到七支用牛皮纸包扎好进行灭菌。

锥形瓶用八层纱布和牛皮纸进行包扎，纱布中间要凹进瓶口，可起到缓冲作用。

（3）枪头：1ml以下的枪头放进枪头盒里，用报纸包好灭菌。

5 ml枪头用长条形报纸逐只进行包扎，然后统一再包起来灭菌。

3 灭菌锅的使用（1）干热灭菌：先把要灭菌的物品放在箱内，堆积时要留有空隙，勿使接触烘箱壁，关闭箱门。

接通电源，调节温度控制旋钮控制温度在要求的温度。

灭菌结束后切断电源，待温度降至60℃时，才能打开箱门。

（2）高压蒸汽灭菌：①使用前先在锅内加入适量的水（以在支架处为宜），然后把需要灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺母，打开排气阀。

②打开电源开关进行加热，待排气阀冒热气3-5min后，关闭排气阀。

待第一次喷气结束后开始计时，15min后关闭电源。

③如果是固体（玻璃仪器）灭菌，灭菌结束后可直接打开排气阀，待压力表回复到零后，打开灭菌锅取出物品。

如果是液体（有培养基）灭菌，必须等到压力回复到零后，先打开排气阀后，再打开灭菌锅，取出物品放到烘箱内烘干。

最后把灭菌后的培养基放到37℃培养箱24 h之后观察有没有菌长出来，如果没有说明灭菌效果很好，反之不好。

④使用结束后，放掉锅内的水，以防生锈。

技能五倒平板一、实验目的了解平板的用途，学会制作平板。

二、实验器材培养皿酒精灯灭菌好的固体培养基三、实验步骤1 将灭菌过的固体培养基和培养皿放进已经灭过菌的超净工作台，然后用酒精棉将手擦拭一遍，然后点燃酒精灯。

2 打开培养皿包裹的牛皮纸，打开锥形瓶的瓶塞。

在酒精灯上方逐个进行倒平板，然后放到超净工作台面上，待其冷却后取出倒扣在37℃恒温培养箱中。

3 24h之后取出观察，如果没有菌长出，放进保鲜袋内封好放冰箱保存备用。

技能六斜面的制作一、实验目的通过制作斜面，掌握斜面制作方法二、实验器材试管酒精灯灭菌好的固体培养基三、实验步骤1.将灭菌好的培养基和试管放进已经灭菌的超净工作台内。

2.在超净工作台内用酒精棉将手擦拭一遍，点燃酒精灯，打开试管包扎纸和。

然后在酒精灯上方进行倒斜面。

每支4-5ml，然后斜靠在支架上，调整使其斜面的顶端在试管的中间处。

3 .待凝固后，将试管放进37℃水浴恒温培养箱，斜面朝下放置一夜，若没有菌长出来，放冰箱保存备用。

技能七菌种的保藏一、实验目的初步掌握菌种的保藏技术。

二、实验原理菌种的保藏基本原理是在挑选优良的纯菌种并使其处于休眠状态（如分生孢子、芽孢等）的基础上，人为的创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持原有的优良性能。

不同的菌采用不同的方法，同时也要注重方法本身的简便性和经济性。

本实验主要介绍斜面低温保存、液体石蜡液封保存和无菌水保存。

三、实验材料菌种斜面、无菌水（灭过菌的）接种环酒精灯四、方法和步骤1 斜面低温保藏法将待保藏的菌种接到适宜的斜面上培养基上，恒温培养，待菌株生长充分后，放入4℃冰箱保存。