直抗阳性和免疫溶贫
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14 MARCH 2008 VOL 319 SCIENCE wLeabharlann Baiduw.sciencemag.org
配血步入基因时代
为了预防输血不良反应和挽 救生命，欧州学者们正在呼吁 用DNA检测替代血清学方法来 鉴定血型
14 MARCH 2008 VOL 319 SCIENCE www.sciencemag.org
抗体筛选方法
MAGNET
MAGNET
MAGNET
MAGNET
DAT阳性血液标本的收集
EDTA抗凝血 提供红细胞 DAT测定，定型，洗脱，自身吸收 不抗凝血 提供血清 抗体筛选，抗体鉴定
DAT阳性血清学研究
多特异性抗球蛋白，抗IgG，抗C3 测定附着在红细胞上的免疫球蛋白的类型 血清抗体筛选与鉴定 自身抗体，同种抗体 自身＋同种抗体 放散试验 确认附着抗体的特异性 直抗（IgG）阳性，而血清与洗脱液皆无反应 需进一步研究： 药物处理细胞，A和B细胞，酶处理细胞
直接抗人球蛋白实验阳性 和免疫溶血性贫血
抗球蛋白试验 - 检测 IgG
通过抗人球蛋白 抗体的特异性桥 连作用，促进红 细胞的凝集。可 分为直接和间接 抗球蛋白试验。
直接抗球蛋白试验
检查受检者红细胞在机体内是否被抗体致敏 产生直抗阳性的条件 自身免疫溶血性贫血 溶血性输血反应 新生儿溶血病
间接抗球蛋白试验
冷自身免疫溶血性贫血的输血
慢性冷凝集素病很少需要输血，但是发生大 量溶血时，病人温度约40 0C的环境。当红细 胞输入开始10分钟红细胞快速在病人血液中 破坏，然后破坏速度变慢 阵发性寒冷性血红蛋白尿患者很少需要输血， 因抗体反应温度常只到20 0C ，所以很少引起 溶血，当抗体反应温度如上升到30 0C即可引 起溶血。输P阴性血，但有人成功的输予没洗 涤，没加温，P阳性的细胞
IgG IAT-反应抗 体和IgM凝集抗 体 通常未知
IgG 没有反应
在DLT试验中 IgG双相溶血 抗P
放散液
血清
特异性
温抗体型自身免疫溶血性贫血(WAIHA)
发病率
1/80000，女性比男性高，年龄多数>40
病因分类
网状内皮细胞肿瘤 胶原病 免疫性疾病 胃肠道疾病 某些良性肿瘤 慢性淋巴瘤;霍奇金病;非霍奇金淋巴瘤病 系统性红斑狼疮;类风湿性关节炎等 免疫缺陷综合症;低球蛋白血症等
证实红细胞在体外被抗体结合的试验 是检查血清中IgG抗体特异性 或红细胞抗原的重要手段 可用于 未知抗体的检出与确认 交叉配合试验 确认抗原
间接抗球蛋白试验
步骤1：致敏 步骤2：洗涤 步骤3：加入抗人球 蛋白试剂（AHG）
增强介质
可以增强反应性和减少孵育时间 LISS 电解质增加溶液的介电常数，减弱了抗原抗 体的静电作用。降低离子强度可以显著增加抗原抗 体结合率 Polybrene 碱性高分子物质，有效中和红细胞表面 负电荷，降低zeta电位，缩短红细胞之间的距离 PeG 极强的亲水性，减少红细胞与抗体周围的水分 22％Bovine albumin Enzymes
自身吸收 区分自身和同种抗体
患者血清：自身抗体+同种抗K 洗涤患者细胞，56 0C水浴中孵育5分钟， 洗脱部分自身抗体 酶处理洗脱红细胞，可增大吸附抗体的 能力 37 0C吸附患者血清，移去自身抗体，只 留下同种抗体
Blood-Matching Goes Genetic
Hoping to prevent adverse transfusion reactions and save lives, European researchers are lobbying to replace serology-based blood typing with matchingbased on DNA tests
免疫抗体 类型
IgG IgG+C3 C3
Mixed-type AIHA
IgG+C3 C3
PCH
C3 only
C3 only
IgG IgG抗体
IAT；在20 C， 35%未凝集 广范围反应；多 种特异性报道
IgM 没有反应
IgM凝集抗体， 4 C效价>1000 (60%) 通常为抗I
IgG,IgM IgG抗体
Hemolytic Transfusion Reaction Hemolytic Disease of the Fetus and Newborn (HDFN)
药物诱发的免疫溶血性贫血
Drug-dependent Drug-independent
自身免疫溶血性贫血的血清学特征
WAIHA CAS DAT
免疫溶血性贫血的分类
自身免疫溶血性贫血（AIHA）
Warm AIHA (WAIHA) Cold Agglutinin Syndrone (CAS) Mixed-type AIHA Paroxysmal Cold Hemoglobinura (PCH) DAT-negative AIHA
同种免疫溶血性贫血
WAIHA 诊断依据
直抗阳性 患者近4个月无输血或特殊药物服用史，结 合临床表现和实验室检查，可诊断为温抗体 型自身免疫溶血性贫血。 直抗阴性 但临床表现较符合本病症状，肾上腺皮质 激素或切脾术有效，其它溶血性贫血除外， 可诊断为抗球蛋白蛋白试验阴性的温抗体型 自身免疫溶血性贫血。
WAIHA 疗效标准
温自身和同种抗体
红细胞疾病
红细胞增多
红细胞减少 红细胞生成减少 红细胞破坏过多（溶血性贫血） 红细胞丢失过多
溶血性贫血
红细胞内在缺陷 遗传性红细胞增多症 红细胞酶缺乏的贫血 珠蛋白生成障碍性贫血 异常血红蛋白病 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 红细胞外来因素 免疫溶血性贫血 机械性溶血性贫血 其它因素引起的溶血性贫血
Mimicking抗体
自身抗体同效（mimicking） 同种抗体
一位rr型患者的血清中有抗C及抗e抗 体，尽管患者的红细胞缺乏C抗原，但事 实上此抗C的反应性，是因温反应性自身 抗体而引起。这种由于自身抗体所致的反 应性，可用自身与同种吸收法来研究决定。 在上述情况中，抗e为自身抗体，抗C抗体 会吸附到自身及同种的r型细胞上，这与 “真实”同种抗C完全不同，后者仅被C阳 性红细胞吸收。
1.Dispensing
H1 H2 H3 Screen Diluent 60 µl of 12 µl of 15 µl of Screen serum or Hemascreen Diluent plasma 1,2,3
NanoLys
60 µl of NanoLys
ScreenLys
2. Incubation 20’ at 37°C 3. Shake and Magnetize in the same time
Blood-Matching Goes Genetic
Two decades ago, a 20-year-old man entered Duke University hospital for a hip replacement. He had sickle cell disease and because he was anemic, he needed a blood transfusion before the operation. As with most sickle cell patients, he had received transfusions before. But on this occasion, his body rejected the blood. The doctors tried again and again with different blood, but the man’s immune system rebelled against every new transfusion, generating antibodies that killed the new blood cells and some of his own in the process. “He reacted to everything,” says Wendell Rosse, a hematologist at Duke at the time. The man’s anemia continued to worsen, and 2 weeks later he died. “There wasn’t anything we could do,” Rosse says.
增强介质
柱凝集（Column agglutination） 固相技术（Solid-phase technology）
Red blood cells panel
Plasma or serum Screen Diluent NanoLys Anti-Human Globulin (AHG)
复合方法
抗体筛选方法
PCH 发病机制
以全身或局部受寒冷刺激后突然发生大量血 管内溶血和血红蛋白尿为特征，罕见 原发性发病者极为罕见 继发性主要由梅毒特别是先天性梅毒及晚期 梅毒静止期所引起，现在此病大多出现于某 些病毒感染，如麻疹、流行性感冒、水痘、 传染性单核细胞增多症等传染病之后，以儿 童居多
PCH 诊断标准
临床表现 患者多数受寒后即有急性发作，表现为寒战、发 热（体温可高达40 0C），全身无力及腰背痛，随后即 有血红蛋白尿，多数持续几小时，偶有几天 实验室检查 1.发作时贫血严重，进展迅速，外周血有红细胞大 小不一及畸形，并有球形红细胞、红细胞碎片、 嗜碱性点彩细胞及幼红细胞； 2.反复发作者有含铁血黄素尿； 3.DL试验阳性； 4.DAT试验阳性，为C3型
红细胞鉴定
定型 ABO/Rh，磷酸氯奎放散，收集网织红细胞 DAT IgG，C3 • 放散 阴性：A和B细胞，酶处理，药物处理细胞 阳性：同种抗体，自身抗体，同种＋自身 自身吸收
血清抗体鉴定
阳性 自身抗体 温抗体，冷抗体 同种抗体 特异性鉴定 自身吸收鉴定同种抗体 阴性 IgG抗A，抗B抗体 酶处理细胞 药物依赖抗体
缓解 患者临床症状消失 部分缓解 患者临床症状基本消失。血红蛋白量在80g/L以上， 网织红细胞数在5％以下，血清总胆红素测定 <34umol/L（2mg/dl）。直抗阴性/阳性。 无效 患者治疗后仍有不同程度的贫血或溶血症状，实验室 检查结果未能达到部分缓解标准者。
温自身抗体与Rh血型抗体
单一的Rh特异性 自身抗-e 复合的Rh特异性 正常红细胞 阳性 阳性 阳性 Rhnull 阴性 阴性 阳性 D--/D-阴性 阳性 阳性 抗体特异性 抗-nl 抗-pdl 抗-dl
DL 冷溶血试验
Donath-Landsteiner test DL冷溶血素IgG冷反应性抗体，能结合于几 乎所有正常人红细胞均有的P血型抗原，是一 种冷温双相温度的冷溶血素，具有强烈的溶 血作用。体外最适反应温度0 0C -4 0C，150C 以下补体不能按序最终激活，故不发生补体 溶血，回升37 0C时抗体与细胞解离，但补体 却依次激活，导致溶血。 先臵于冰水中约30分钟，再臵于37 0C水浴中2 小时，溶血，DL抗体存在。
温自身抗体（广范围抗dl＋自身抗e）
编号 1 2 3 4 5 D + + + + C + + + E + c + + + e + + + +
AHG（37 0C ）
2+ 2+ w+ 2+ 3+
6 7
8
-
-
+ -
+ +
+
+ +
+
w+ 2+
2+
CAS 发病机制
当体温较低（300C以下）时这种冷抗体能作 用于自身红细胞抗原而发生可逆性的红细胞 凝集。凝集的红细胞阻塞微循环而发绀，可 伴有轻度的溶血。温度回升，症状消失。 原发性者原因不明 继发性者相对多见于支原体肺炎以及传染性 单核细胞增多症恢复期
抗体放散方法
方法 用途 要点
快速；红细胞用量少； 其它抗体难放散 容易；IgG同种和自身 抗体难放散
容易；当高效价的抗体存 在时放散液有假阳性
Lui freeze-thaw ABO HDFN
Heat(56 0C)
ABO HDFN； IgM凝集抗体
酸放散试剂盒 温自身和同种抗体
洋地黄皂苷酸 温自身和同种抗体 洗涤消耗时间 乙醚放散
WAIHA 发病机制
免疫调节紊乱
• 免疫器官对自身红细胞失去识别能力 • 红细胞膜损伤，改变膜的抗原性
WAIHA 诊断标准
临床表现
起病慢，数月后才发现贫血，表现为全身虚弱及头昏。 各有1/3患者皮肤粘膜苍白及黄胆，半数以上有脾肿大。
实验室检查
1.贫血：程度不一，可暴发急性溶血现象。外周血涂片上可见 多量球形细胞及数量不等的幼红细胞，； 2.骨髓涂片：呈幼红细胞增生象； 3.再生危象：网织红细胞极度减少，骨髓象呈细胞再生障碍， 血象呈全细胞减少； 4.DAT试验阳性，为抗IgG和抗C3型。
CAS 诊断标准
临床表现
以中老年患者为多，寒冷环境使患者耳郭、鼻尖、 手指发绀，但一经加温即消失。除贫血和黄疸外，其 他体症很少
实验室检查
1.患者呈慢性轻至中度贫血，外周血中无红细胞 畸形，可有轻度高胆红素血症； 2.反复发作者有含铁血黄素尿； 3.冷凝集素试验阳性，40C效价>1000； 4.DAT试验阳性，为C3型
配血步入基因时代
为了预防输血不良反应和挽 救生命，欧州学者们正在呼吁 用DNA检测替代血清学方法来 鉴定血型
14 MARCH 2008 VOL 319 SCIENCE www.sciencemag.org
抗体筛选方法
MAGNET
MAGNET
MAGNET
MAGNET
DAT阳性血液标本的收集
EDTA抗凝血 提供红细胞 DAT测定，定型，洗脱，自身吸收 不抗凝血 提供血清 抗体筛选，抗体鉴定
DAT阳性血清学研究
多特异性抗球蛋白，抗IgG，抗C3 测定附着在红细胞上的免疫球蛋白的类型 血清抗体筛选与鉴定 自身抗体，同种抗体 自身＋同种抗体 放散试验 确认附着抗体的特异性 直抗（IgG）阳性，而血清与洗脱液皆无反应 需进一步研究： 药物处理细胞，A和B细胞，酶处理细胞
直接抗人球蛋白实验阳性 和免疫溶血性贫血
抗球蛋白试验 - 检测 IgG
通过抗人球蛋白 抗体的特异性桥 连作用，促进红 细胞的凝集。可 分为直接和间接 抗球蛋白试验。
直接抗球蛋白试验
检查受检者红细胞在机体内是否被抗体致敏 产生直抗阳性的条件 自身免疫溶血性贫血 溶血性输血反应 新生儿溶血病
间接抗球蛋白试验
冷自身免疫溶血性贫血的输血
慢性冷凝集素病很少需要输血，但是发生大 量溶血时，病人温度约40 0C的环境。当红细 胞输入开始10分钟红细胞快速在病人血液中 破坏，然后破坏速度变慢 阵发性寒冷性血红蛋白尿患者很少需要输血， 因抗体反应温度常只到20 0C ，所以很少引起 溶血，当抗体反应温度如上升到30 0C即可引 起溶血。输P阴性血，但有人成功的输予没洗 涤，没加温，P阳性的细胞
IgG IAT-反应抗 体和IgM凝集抗 体 通常未知
IgG 没有反应
在DLT试验中 IgG双相溶血 抗P
放散液
血清
特异性
温抗体型自身免疫溶血性贫血(WAIHA)
发病率
1/80000，女性比男性高，年龄多数>40
病因分类
网状内皮细胞肿瘤 胶原病 免疫性疾病 胃肠道疾病 某些良性肿瘤 慢性淋巴瘤;霍奇金病;非霍奇金淋巴瘤病 系统性红斑狼疮;类风湿性关节炎等 免疫缺陷综合症;低球蛋白血症等
证实红细胞在体外被抗体结合的试验 是检查血清中IgG抗体特异性 或红细胞抗原的重要手段 可用于 未知抗体的检出与确认 交叉配合试验 确认抗原
间接抗球蛋白试验
步骤1：致敏 步骤2：洗涤 步骤3：加入抗人球 蛋白试剂（AHG）
增强介质
可以增强反应性和减少孵育时间 LISS 电解质增加溶液的介电常数，减弱了抗原抗 体的静电作用。降低离子强度可以显著增加抗原抗 体结合率 Polybrene 碱性高分子物质，有效中和红细胞表面 负电荷，降低zeta电位，缩短红细胞之间的距离 PeG 极强的亲水性，减少红细胞与抗体周围的水分 22％Bovine albumin Enzymes
自身吸收 区分自身和同种抗体
患者血清：自身抗体+同种抗K 洗涤患者细胞，56 0C水浴中孵育5分钟， 洗脱部分自身抗体 酶处理洗脱红细胞，可增大吸附抗体的 能力 37 0C吸附患者血清，移去自身抗体，只 留下同种抗体
Blood-Matching Goes Genetic
Hoping to prevent adverse transfusion reactions and save lives, European researchers are lobbying to replace serology-based blood typing with matchingbased on DNA tests
免疫抗体 类型
IgG IgG+C3 C3
Mixed-type AIHA
IgG+C3 C3
PCH
C3 only
C3 only
IgG IgG抗体
IAT；在20 C， 35%未凝集 广范围反应；多 种特异性报道
IgM 没有反应
IgM凝集抗体， 4 C效价>1000 (60%) 通常为抗I
IgG,IgM IgG抗体
Hemolytic Transfusion Reaction Hemolytic Disease of the Fetus and Newborn (HDFN)
药物诱发的免疫溶血性贫血
Drug-dependent Drug-independent
自身免疫溶血性贫血的血清学特征
WAIHA CAS DAT
免疫溶血性贫血的分类
自身免疫溶血性贫血（AIHA）
Warm AIHA (WAIHA) Cold Agglutinin Syndrone (CAS) Mixed-type AIHA Paroxysmal Cold Hemoglobinura (PCH) DAT-negative AIHA
同种免疫溶血性贫血
WAIHA 诊断依据
直抗阳性 患者近4个月无输血或特殊药物服用史，结 合临床表现和实验室检查，可诊断为温抗体 型自身免疫溶血性贫血。 直抗阴性 但临床表现较符合本病症状，肾上腺皮质 激素或切脾术有效，其它溶血性贫血除外， 可诊断为抗球蛋白蛋白试验阴性的温抗体型 自身免疫溶血性贫血。
WAIHA 疗效标准
温自身和同种抗体
红细胞疾病
红细胞增多
红细胞减少 红细胞生成减少 红细胞破坏过多（溶血性贫血） 红细胞丢失过多
溶血性贫血
红细胞内在缺陷 遗传性红细胞增多症 红细胞酶缺乏的贫血 珠蛋白生成障碍性贫血 异常血红蛋白病 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 红细胞外来因素 免疫溶血性贫血 机械性溶血性贫血 其它因素引起的溶血性贫血
Mimicking抗体
自身抗体同效（mimicking） 同种抗体
一位rr型患者的血清中有抗C及抗e抗 体，尽管患者的红细胞缺乏C抗原，但事 实上此抗C的反应性，是因温反应性自身 抗体而引起。这种由于自身抗体所致的反 应性，可用自身与同种吸收法来研究决定。 在上述情况中，抗e为自身抗体，抗C抗体 会吸附到自身及同种的r型细胞上，这与 “真实”同种抗C完全不同，后者仅被C阳 性红细胞吸收。
1.Dispensing
H1 H2 H3 Screen Diluent 60 µl of 12 µl of 15 µl of Screen serum or Hemascreen Diluent plasma 1,2,3
NanoLys
60 µl of NanoLys
ScreenLys
2. Incubation 20’ at 37°C 3. Shake and Magnetize in the same time
Blood-Matching Goes Genetic
Two decades ago, a 20-year-old man entered Duke University hospital for a hip replacement. He had sickle cell disease and because he was anemic, he needed a blood transfusion before the operation. As with most sickle cell patients, he had received transfusions before. But on this occasion, his body rejected the blood. The doctors tried again and again with different blood, but the man’s immune system rebelled against every new transfusion, generating antibodies that killed the new blood cells and some of his own in the process. “He reacted to everything,” says Wendell Rosse, a hematologist at Duke at the time. The man’s anemia continued to worsen, and 2 weeks later he died. “There wasn’t anything we could do,” Rosse says.
增强介质
柱凝集（Column agglutination） 固相技术（Solid-phase technology）
Red blood cells panel
Plasma or serum Screen Diluent NanoLys Anti-Human Globulin (AHG)
复合方法
抗体筛选方法
PCH 发病机制
以全身或局部受寒冷刺激后突然发生大量血 管内溶血和血红蛋白尿为特征，罕见 原发性发病者极为罕见 继发性主要由梅毒特别是先天性梅毒及晚期 梅毒静止期所引起，现在此病大多出现于某 些病毒感染，如麻疹、流行性感冒、水痘、 传染性单核细胞增多症等传染病之后，以儿 童居多
PCH 诊断标准
临床表现 患者多数受寒后即有急性发作，表现为寒战、发 热（体温可高达40 0C），全身无力及腰背痛，随后即 有血红蛋白尿，多数持续几小时，偶有几天 实验室检查 1.发作时贫血严重，进展迅速，外周血有红细胞大 小不一及畸形，并有球形红细胞、红细胞碎片、 嗜碱性点彩细胞及幼红细胞； 2.反复发作者有含铁血黄素尿； 3.DL试验阳性； 4.DAT试验阳性，为C3型
红细胞鉴定
定型 ABO/Rh，磷酸氯奎放散，收集网织红细胞 DAT IgG，C3 • 放散 阴性：A和B细胞，酶处理，药物处理细胞 阳性：同种抗体，自身抗体，同种＋自身 自身吸收
血清抗体鉴定
阳性 自身抗体 温抗体，冷抗体 同种抗体 特异性鉴定 自身吸收鉴定同种抗体 阴性 IgG抗A，抗B抗体 酶处理细胞 药物依赖抗体
缓解 患者临床症状消失 部分缓解 患者临床症状基本消失。血红蛋白量在80g/L以上， 网织红细胞数在5％以下，血清总胆红素测定 <34umol/L（2mg/dl）。直抗阴性/阳性。 无效 患者治疗后仍有不同程度的贫血或溶血症状，实验室 检查结果未能达到部分缓解标准者。
温自身抗体与Rh血型抗体
单一的Rh特异性 自身抗-e 复合的Rh特异性 正常红细胞 阳性 阳性 阳性 Rhnull 阴性 阴性 阳性 D--/D-阴性 阳性 阳性 抗体特异性 抗-nl 抗-pdl 抗-dl
DL 冷溶血试验
Donath-Landsteiner test DL冷溶血素IgG冷反应性抗体，能结合于几 乎所有正常人红细胞均有的P血型抗原，是一 种冷温双相温度的冷溶血素，具有强烈的溶 血作用。体外最适反应温度0 0C -4 0C，150C 以下补体不能按序最终激活，故不发生补体 溶血，回升37 0C时抗体与细胞解离，但补体 却依次激活，导致溶血。 先臵于冰水中约30分钟，再臵于37 0C水浴中2 小时，溶血，DL抗体存在。
温自身抗体（广范围抗dl＋自身抗e）
编号 1 2 3 4 5 D + + + + C + + + E + c + + + e + + + +
AHG（37 0C ）
2+ 2+ w+ 2+ 3+
6 7
8
-
-
+ -
+ +
+
+ +
+
w+ 2+
2+
CAS 发病机制
当体温较低（300C以下）时这种冷抗体能作 用于自身红细胞抗原而发生可逆性的红细胞 凝集。凝集的红细胞阻塞微循环而发绀，可 伴有轻度的溶血。温度回升，症状消失。 原发性者原因不明 继发性者相对多见于支原体肺炎以及传染性 单核细胞增多症恢复期
抗体放散方法
方法 用途 要点
快速；红细胞用量少； 其它抗体难放散 容易；IgG同种和自身 抗体难放散
容易；当高效价的抗体存 在时放散液有假阳性
Lui freeze-thaw ABO HDFN
Heat(56 0C)
ABO HDFN； IgM凝集抗体
酸放散试剂盒 温自身和同种抗体
洋地黄皂苷酸 温自身和同种抗体 洗涤消耗时间 乙醚放散
WAIHA 发病机制
免疫调节紊乱
• 免疫器官对自身红细胞失去识别能力 • 红细胞膜损伤，改变膜的抗原性
WAIHA 诊断标准
临床表现
起病慢，数月后才发现贫血，表现为全身虚弱及头昏。 各有1/3患者皮肤粘膜苍白及黄胆，半数以上有脾肿大。
实验室检查
1.贫血：程度不一，可暴发急性溶血现象。外周血涂片上可见 多量球形细胞及数量不等的幼红细胞，； 2.骨髓涂片：呈幼红细胞增生象； 3.再生危象：网织红细胞极度减少，骨髓象呈细胞再生障碍， 血象呈全细胞减少； 4.DAT试验阳性，为抗IgG和抗C3型。
CAS 诊断标准
临床表现
以中老年患者为多，寒冷环境使患者耳郭、鼻尖、 手指发绀，但一经加温即消失。除贫血和黄疸外，其 他体症很少
实验室检查
1.患者呈慢性轻至中度贫血，外周血中无红细胞 畸形，可有轻度高胆红素血症； 2.反复发作者有含铁血黄素尿； 3.冷凝集素试验阳性，40C效价>1000； 4.DAT试验阳性，为C3型