斑马鱼耳聋基因Gfi与POU4f3的关联性
斑马鱼胚胎发育阶段相关基因的挖掘与分析
斑马鱼胚胎发育阶段相关基因的挖掘与分析近年来，斑马鱼成为一种常用的实验室模式生物，其胚胎发育过程十分规律和可控，是研究发育生物学和基因调控机制的重要模型。
随着基因挖掘技术的不断发展，越来越多的基因与斑马鱼胚胎发育阶段相关性得到了发现。
因此，分析斑马鱼胚胎发育阶段相关基因的功能和调控机制对于揭示生命活动的本质有着至关重要的意义。
一、斑马鱼胚胎发育阶段及其分子机制斑马鱼是一种小型热带鱼类，其胚胎发育阶段可分为十几个时期，分别对应着不同的形态和生理特征。
这些不同的发育阶段均是由基因表达的时空调控所驱动的，特定的基因激活和抑制导致了不同的胚胎形态和器官功能的发生。
在斑马鱼的早期发育过程中，主要涉及到卵母细胞的受精和初胚形成。
此阶段的发育主要由母源性基因调控，如 nop5、dead end、Vasa等。
随着器官的逐渐形成，受精卵将发展成为由脑、眼、肌肉等不同组织构成的多细胞胚胎。
这个过程中涉及到神经、视觉、肌肉等多种发育生物学特征，同时也是多个信号通路的交错调节，如 BMP、Wnt、Notch、Hedgehog等。
在胚胎发育的晚期，涉及到器官的成熟和功能细化等生理特征。
这个过程也是多种生化信号和调节因子交错作用下的结果，其主要涉及到细胞增殖、周期、分化等方面的调控，如 Cyclin D1、Nodal、Sox9等。
以上所述只是基础的胚胎发育阶段及其分子机制，实际上与胚胎发育相关的基因非常多且复杂。
因此，对斑马鱼胚胎发育相关基因的挖掘与分析显得尤为重要。
二、斑马鱼胚胎发育相关基因的挖掘通常，对基因的挖掘可以通过多种方式进行。
例如，可以通过对小分子化学物质的筛选和识别来验证潜在的胚胎发育相关基因，或者采用基于全反式PCR和转录组测序技术的方法进行基因调控因子的预测和鉴定。
另外，通过胚胎发育过程中的突变模式和形态，可获得一些具有生物学意义的候选基因，对其功能的研究也是非常重要的。
目前，已经有大量的胚胎发育相关基因在斑马鱼中被发现并得到了鉴定。
斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达
斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达作者：陈华林晨韬陈曦葛均青来源：《南方农业学报》2022年第01期摘要：【目的】實现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达，以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白，为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。
【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析，经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因，亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以IPTG进行诱导表达，并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。
【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。
Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp，共编码196个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp，共编码191个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。
Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽，而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构，但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。
在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中，Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近，而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。
将合成的斑马鱼 g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞，20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h，可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2，纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL，对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。
两个Sox9基因在斑马鱼胚胎发育和成体性腺中的动态表达特征
两个Sox9基因在斑马鱼胚胎发育和成体性腺中的动态表达特征作者：梁清仪王心仪孙冬捷等来源：《山东农业科学》2014年第07期摘要：通过整体原位杂交和切片原位杂交技术系统全面地比较分析了斑马鱼胚胎四个发育时期（12、24、48 hpf和4 dpf）和成熟性腺中Sox9a和Sox9b基因的表达模式。
结果显示，两个Sox9基因在脑和眼中持续表达，但在耳囊、头部软骨、胸鳍芽和体节中差异性表达。
Sox9a 特异性地在侧线、尾部神经嵴、原肾管和精巢支持细胞中表达，而Sox9b在卵巢的卵黄颗粒中大量表达。
与已发表的研究结果相比，本研究更广泛地揭示了Sox9a和Sox9b的动态差异表达模式，且更清楚地显示了其在性腺中的表达特征。
关键词：Sox9a；Sox9b；斑马鱼；胚胎发育；成体性腺中图分类号：Q959.46+8∶Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0020-05AbstractUsing whole mount and tissue section in situ hybridization techniques， the expression patterns of two Sox9 homologues genes，Sox9a and Sox9b，were comprehensively compared and analyzed in four stages of developing embryo （12， 24， 48 hpf and 4 dpf） and mature gonads of zebrafish （Danio rerio）. The two genes were persistently expressed in brain and eyes，but differentially expressed in otic vesicle， head cartilage， pectoral fin buds and somites. Distinct from high expression of Sox9b in the yolk granules of oocytes， Sox9a was specifically expressed in lateral line， tail neural crest， primary renal tubular and Sertoli cells in testis. Compared with other published results， the present data revealed a more extensive differential expression profile of two Sox9 genes in the developing embryo and gonads of zebrafish.Key wordsSox9a； Sox9b；Zebrafish（Danio rerio）； Embryonic development； GonadSox9被普遍认为是雄性睾丸决定必须基因，但其功能并不局限于性腺。
斑马鱼多能性因子的研究进展
Abstract: The mammalian pluripotency factors, including transcription factors such as Pou5f1/Oct4, Sox2, Klf4 and Nanog, play critical roles in maintaining pluripotency of embryonic stem cells and inducing reprogramming of differentiated cells. However, the functions of vertebrate pluripotency factors in vivo have not been elucidated. Zebrafish(Danio rerio H.) is an excellent model for studying vertebrates’ early embryo development. It allows functional studies of pluripotency factors to be conducted in an in vivo environment and therefore provides more accurate information on their roles. Nowadays, several homologs of mammalian pluripotency factors including oct4, nanog etc. have been identified in zebrafish. This review aimed at introducing the progress of the functional study on zebrafish pluripotency factors and comparing to those of other vertebrates.
双酚F 对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究
生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第16卷第3期2021年6月V ol.16,No.3Jun.2021㊀㊀基金项目:国家重点研发计划资助项目(2018YFC1801501);国家重点研发计划资助项目(2018YFC1706500)㊀㊀第一作者:杨倩(1986 ),女,博士,研究方向为生态毒理学,E -mail:jsyqhappy@ ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:clh_helen@DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20200909004杨倩,刘建梅,丁洁,等.双酚F 对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究[J].生态毒理学报,2021,16(3):166-178Yang Q,Liu J M,Ding J,et al.Endocrine disrupting effects of bisphenol F on early life stages of zebrafish [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2021,16(3):166-178(in Chinese)双酚F 对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究杨倩1,刘建梅2,丁洁2,陈丽红3,*1.南京财经大学食品科学与工程学院,南京2100232.江苏雅信昆成检测科技有限公司,南京2100343.南京中医药大学药学院,南京210023收稿日期:2020-09-09㊀㊀录用日期:2020-10-26摘要:双酚A(bisphenol,BPA)的内分泌干扰性导致许多国家出台了管控措施,双酚F(bisphenol F,BPF)作为其替代物被大量使用,并广泛存在于水体和食品中,导致人群和野生动物长期处于其慢性暴露过程中,可能会威胁人类和生态健康㊂以斑马鱼胚胎为研究模型,将其暴露于不同浓度的BPF 中至受精后144h (hours post fertilization,hpf),研究BPF 对斑马鱼胚胎发育阶段的内分泌干扰作用㊂结果表明,BPF 能够导致斑马鱼的畸形率升高,且具有剂量-效应关系㊂斑马鱼胚胎暴露于100μg ㊃L -1和1000μg ㊃L -1BPF 后,引起了三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)水平升高,甲状腺素(thyroxine,T4)和类固醇皮质醇(corti -sol,C)水平降低;而10μg ㊃L -1以上浓度BPF 导致17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的水平显著性升高,睾酮(testosterone,T)水平显著性降低㊂另外,BPF 导致下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamic -pituitary -thyroid,HPT)轴㊁下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic -pitui -tary -gonadal,HPG)轴和下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic -pituitary -adrenal,HPA)轴上一系列基因表达水平发生改变,这些改变会影响斑马鱼的内分泌功能,进而可能会对生物体的生长发育产生影响㊂关键词:双酚F ;斑马鱼;内分泌干扰效应;下丘脑-垂体-甲状腺轴;下丘脑-垂体-性腺轴;下丘脑-垂体-肾上腺轴文章编号:1673-5897(2021)3-166-13㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AEndocrine Disrupting Effects of Bisphenol F on Early Life Stages of Ze-brafishYang Qian 1,Liu Jianmei 2,Ding Jie 2,Chen Lihong 3,*1.College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China2.Jiangsu Yaxin Tech.Co.Ltd.,Nanjing 210034,China3.School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,ChinaReceived 9September 2020㊀㊀accepted 26October 2020Abstract :Bisphenol A (BPA)has been banned in certain products due to its endocrine disrupting effects.Because of the restrictions,bisphenol F (BPF)has been developed to substitute BPA in the manufacture of polycarbonate and epoxy resins.The increased application of BPF has resulted in ubiquitous food and environmental pollution,thus humans and wild animals are the most likely to be under chronic exposure.In this study,zebrafish embryos were exposed to BPF from 2to 144hours post fertilization (hpf)to investigate the endocrine disrupting effects of. All Rights Reserved.第3期杨倩等:双酚F 对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究167㊀BPF on early life stages of zebrafish.The results revealed that BPF increased the mortality in a dose -dependent manner.Exposure to 100μg ㊃L -1and 1000μg ㊃L -1BPF increased triiodothyronine (T3)and 17β-estradiol (E2)levels,and decreased thyroxine (T4)and cortisol (C)levels.10,100and 1000μg ㊃L -1BPF increased E2levels,and decreased testosterone (T)levels.Expression of related genes along the hypothalamic -pituitary -thyroid (HPT),hypothalamic -pituitary -gonadal (HPG)and hypothalamic -pituitary -adrenal (HPA)axes were also evaluated.Chan -ges of gene expression in the HPT,HPG and HPA axes caused by BPF can affect the endocrine function of ze -brafish,which may affect the growth and development of zebrafish.Keywords :bisphenol F;zebrafish;endocrine disrupting effects;hypothalamic -pituitary -thyroid axis;hypothalamic -pituitary -gonadal axis;hypothalamic -pituitary -adrenal axis ㊀㊀双酚A(bisphenol A,BPA)广泛用于食品包装材料㊁奶瓶㊁水杯以及其他数百种日用品的制造过程[1]㊂作为一种典型的内分泌干扰物,全球许多国家和地区都出台了法律法规限制双酚A 的使用㊂为了应对管控措施和市场需求,一些结构与BPA 类似㊁可耐受较高温度的化合物被开发用来替代BPA ,这些化合物具有2个羟苯基结构,在羟苯基和碳桥具有不同的取代基,统称为双酚A 类似物,其中,双酚F(bisphenol F,BPF)在食品和环境样品中均是仅次于BPA 的检出量最大的双酚A 类似物[2-3]㊂BPF(系统名4,4二羟基二苯基甲烷,英文名为4,4 -dihydroxydiphenylmethane)和BPA 的结构式如图1所示㊂对日本㊁韩国和中国采集的河水和海水中,BPF 在几个采样点的浓度甚至超过1000ng ㊃L -1,而在日本东京的Tamagawa 河水中,BPF 浓度高达2850ng ㊃L -1,已经超过了欧盟规定BPA 对水生生物的预测无效应浓度(1500ng ㊃L -1)[4]㊂随着BPF 使用量的逐年增加,其污染情况可能会日益严重㊂图1㊀双酚A (BPA )和双酚F (BPF )的分子结构图Fig.1㊀Chemical structures for bisphenol A (BPA)and bisphenol F (BPF)㊀㊀由于BPF 的结构与BPA 类似,预计可能对生物系统产生同样的毒性效应㊂一些体内外实验结果表明,BPF 具有与BPA 相似的雌激素效应㊂Kitamura 等[5]采用MCF -7细胞的荧光素酶报告基因法检测发现,BPF 的雌激素活性与BPA 处于同一数量级㊂在H295类固醇生成试验中,BPF 能够引起孕激素和雌激素水平的升高,以及雄激素水平的下降[6]㊂对斑马鱼模式生物的研究发现,对斑马鱼进行60d 的BPF 长期暴露能够导致斑马鱼性激素水平紊乱,性别比例向雌鱼偏离[7]㊂Ullah 等[8]的研究表明,BPF 具有抗雄激素效应,能够导致氧化应激损伤,进而影响大鼠的生殖功能㊂化合物的内分泌干扰效应会对生物体正常的内分泌活动产生干扰㊂生物体的内分泌系统主要由下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴㊁下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴分别控制,这些系统通过调节激素的合成㊁分泌㊁贮存㊁转运和代谢过程来调控内分泌系统,每个内分泌轴与其他内分泌轴相互作用,以协调身体机能[9]㊂内分泌干扰物(endocrine disrupting chemi -cals,EDCs)进入生物体内后导致的HPT ㊁HPG 和HPA 轴的改变,可能会对整个生物体的发育和繁殖机能产生影响㊂一些研究表明,HPT ㊁HPG 和HPA 轴间具有交互作用,例如性激素能够通过应激反应,直接或间接调节HPA 轴的功能,影响肾上腺皮质激素㊁糖皮质激素和促皮质醇释放激素(CRH)等的合成和释放[10-13],而CRH 又是连接HPT 和HPA 轴的关键蛋白之一,并且在鱼类中,CRH 比促甲状腺激素释放激素(thyrotropin -releasing hormone,TRH)能够更有效地调节HPT 轴的功能[12,14]㊂此外,HPT 和HPG 轴间也具有交互作用,甲状腺激素水平可能在正常生殖㊁性类固醇水平和相关酶的基因表达中发挥关键作用[12-16],例如,Zhu 等[17]发现甲状腺素(thyrox -ine,T4)可以促进鲶鱼卵泡的生长,而噻虫嗪降低了稀有鮈鲫体内的T4水平,同时抑制了性腺的发育[18]㊂斑马鱼(Danio rerio )的基因与人类基因相似度达到87%,在关键性的蛋白靶点区域相似性接近100%,另外,斑马鱼内分泌系统分子性质和激素信号通路与其他脊椎动物类似,因此,斑马鱼可以作为模式生物用于内分泌干扰的机理研究[19-20]㊂目前针对BPF 的研究多集中在雌激素效应方面,缺少BPF. All Rights Reserved.168㊀生态毒理学报第16卷对HPT㊁HPG和HPA轴的影响及其交互作用研究㊂因此本文以斑马鱼为研究模型,通过对HPT㊁HPG 和HPA轴激素以及相关基因表达水平的测定,研究BPF对胚胎和仔鱼期斑马鱼内分泌系统的影响及作用机制,以期为BPF潜在的健康风险评价提供科学依据㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀材料与试剂双酚F,CAS号620-92-8,纯度>98%,购于美国J&K公司;用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(DEPC 水),购于中国上海杰瑞生物工程有限公司;雌二醇酶联免疫试剂盒㊁睾酮酶联免疫试剂盒㊁糖皮质激素酶联免疫试剂盒㊁三碘甲状腺原氨酸酶联免疫试剂盒及四碘甲状腺原氨酸酶联免疫试剂盒(96T),购于中国武汉艾博伊科技有限公司;RNA Later,化学纯,购于美国赛默飞世尔科技公司;Trizol试剂购于美国英杰生命技术有限公司;ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒(200次),购于东洋纺(上海)生物科技有限公司;Sso fast EvaGreen Supermix购于美国伯乐公司;甲醇㊁乙醇㊁乙腈均为色谱纯,购于德国Merck公司;水为Milli-Q超纯水㊂1.2㊀仪器与设备显微镜(DM2500型,德国Leica)㊁冷冻离心机(2-16PK型,美国Sigma公司)㊁生态培养箱(CLIMA-CELL型,德国MMM公司)㊁高效液相色谱串联质谱仪(LC-Agilent Technologies1290Infinity,MS-AB SCIEX QTRAP4500)㊁荧光定量PCR仪(CFX96TM Op-tics型,美国Bio-Rad公司)㊁酶标仪(Infinite M200型,瑞士TECAN公司)㊁核酸蛋白分析仪(DU800SERIES 型,美国Sigma公司)㊁多功能水质参数测定仪(HQ40d型,美国HACH公司)㊁电热恒温培养箱(IN-NOV A®43型,中国郑州南北仪器设备有限公司)㊁旋转蒸发仪(R-210型㊁B-491型㊁V-850型,瑞士BU-CHI公司)㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀斑马鱼驯化和胚胎收集四月龄野生成年斑马鱼(AB型)购于中国科学院武汉水生生物研究所,并在实验室斑马鱼养殖系统中养殖并繁殖了3代以上㊂系统运行期间,光照/黑暗周期设定为16hʒ8h(光照ʒ黑暗),维持温度在26ħʃ1ħ,每天定时投喂丰年虾2次㊂前1天晚上将3条雌性斑马鱼和3条雄性斑马鱼放置于每个孵化盒中,孵化盒中间用自带的隔板将雌雄鱼隔开,防止提前产卵㊂孵化盒底部具有筛板,可以将成鱼与缸底隔开,防止成鱼吞食鱼卵㊂第2天早上开灯时将隔板抽出,让雌鱼和雄鱼在光照刺激下交配产卵㊂1h后收集孵化盒底部的胚胎,用清水清洗2遍,在体式显微镜下观察,去除死卵和未受精的卵,收集质量高的胚胎,置于26ħ恒温光照培养箱中待用㊂在斑马鱼胚胎受精后2~4h并处于囊胚期时进行暴露实验㊂1.3.2㊀暴露实验使用前将BPF用二甲基亚砜(DMSO)配制成10000mg㊃L-1的贮备液,储存于4ħ,实验中所用相应浓度的暴露液用斑马鱼养殖水稀释,保证暴露液中的DMSO含量不超过溶液体积的0.01%(V/V)㊂根据BPF对水环境的污染状况,以及BPF对斑马鱼成鱼及胚胎的96h半数致死效应浓度(LC50) (分别为9.51mg㊃L-1和7.5mg㊃L-1)[21],取其1/10作为最高浓度组来研究BPF潜在的毒性效应,浓度分别设置为1㊁10㊁100和1000μg㊃L-1,同时设置空白对照组,暴露容器为1000mL小烧杯,加入500mL 暴露溶液,每个浓度设置3个平行,每个平行随机放置200粒发育正常且处于囊胚期的受精卵,用保鲜膜覆盖在烧杯口处以防止溶液挥发㊂暴露144h期间,所有的小烧杯置于生态培养箱中,设置生态培养箱温度为26ħ,光照周期为16hʒ8h(光照ʒ黑暗),光照强度50lux㊂每日及时清除死亡胚胎,以免污染到其他胚胎或仔鱼㊂试验期间每24h更换暴露溶液,并清洗容器㊂在暴露的不同阶段,随机选取20条鱼,在显微镜下观察( 20倍),统计畸形发育情况并拍照㊂1.3.3㊀暴露溶液中BPF的化学分析为了确定暴露溶液中BPF的实际浓度,采用液相色谱串联质谱仪对各个暴露组进行分析㊂由于每天更换暴露液,因此所有暴露组都只在暴露第1天溶液配制好后(0h)和换水前(24h)这2个时间点收集,以表征暴露溶液在试验期间的变化情况㊂水样的处理和净化方法㊁液相色谱条件和质谱条件见Yang等[7]的研究㊂1.3.4㊀激素水平分析暴露结束后,在每个平行中随机挑选出100条仔鱼置于-80ħ保存,用于激素水平的测定㊂激素测定的具体的方法为:将仔鱼称重,加入4倍体积预. All Rights Reserved.第3期杨倩等:双酚F对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究169㊀冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),缓冲液中加入1μg㊃L-1蛋白酶抑制剂㊂用匀浆器将斑马鱼仔鱼进行全组织充分匀浆后,12000 g,4ħ离心20min,收集上清液并分装,置于-80ħ保存直至采用酶联免疫吸附法进行17β-雌二醇(17β-es-tradiol,E2)㊁睾酮(testosterone,T)㊁三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)㊁T4和类固醇皮质醇(cortisol, C)这5种激素的测定㊂使用鱼类E2㊁T㊁T3㊁T4和C 试剂盒(中国武汉艾博伊科技有限公司)进行分析时,严格按照试剂盒的说明书进行操作,用酶标仪进行测定㊂1.3.5㊀基因转录水平分析在暴露至受精后144h,每个平行随机挑选取20条仔鱼,置于RNAlater中,保存于-20ħ冰箱,用于基因转录水平的分析㊂采用Trizol试剂,严格按照说明书的要求提取总RNA,获得的RNA溶液分装后置于-80ħ冰箱待用,以琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的质量㊂用核酸蛋白测定仪测定RNA 样品在260nm的吸光值,计算总RNA的浓度㊂同时根据总RNA的A260/A280的比值来确定总RNA 的纯度㊂采用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒对所提取的RNA进行反转录,合成cDNA㊂所合成的cDNA样品保存于-20ħ,进行荧光定量PCR时,作为模板直接或稀释后添加㊂实时荧光定量PCR反应在BIO-RAD公司的CFX96TM Optics仪器上进行,根据SYBR Green PCR kit说明书操作㊂实验中所采用的目标基因和管家基因相关引物信息如表1所示㊂引物信息根据引物设计标准,用Primer Premier5.0软件设计㊂表1㊀下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴㊁下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴和下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴相关基因的引物序列信息Table1㊀Primers for genes related to hypothalamic-pituitary-gonadal(HPG)axis, hypothalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis and hypothalamic-pituitary-thyroid(HPT)axis基因Gene登记号Accession No.引物序列(5 ~3 )Sequence of the primer(5 ~3 )β-actin NM_131031Forward-TGCTGTTTTCCCCTCCATTGReverse-TCCCATGCCAACCATCACTgnrh2AY657018Forward-CTGAGACCGCAGGGAAGAAA Reverse-TCACGAATGAGGGCATCCAgnrh3NM_182887Forward-TTGCCAGCACTGGTCATACG Reverse-TCCATTTCACCAACGCTTCTTgnrhr1NM_001144980Forward-ACCCGAATCCTCGTGGAAA Reverse-TCCACCCTTGCCCTTACCAgnrhr2NM_001144979Forward-CAACCTGGCCGTGCTTTACT Reverse GGACGTGGGAGCGTTTTCTfshβNM_205624Forward-GCTGTCGACTCACCAACATCTC Reverse-GTGACGCAGCTCCCACATTlhβNM_205622Forward-GGCTGCTCAGAGCTTGGTTT Reverse-TCCACCGATACCGTCTCATTTAcyp19a1b AF183908Forward-GTCGTTACTTCCAGCCATTCG Reverse-GCAATGTGCTTCCCAACACAerαNM_152959Forward-CAGACTGCGCAAGTGTTATGAAG Reverse-CGCCCTCCGCGATCTTer2βNM_174862Forward-TTCACCCCTGACCTCAAGCT Reverse-TCCATGATGCCTTCAACACAAar NM_001083123Forward-TCTGGGTTGGAGGTCCTACAA Reverse-GGTCTGGAGCGAAGTACAGCATfshr NM_001001812Forward-CGTAATCCCGCTTTTGTTCCT Reverse-CCATGCGCTTGGCGATAlhr AY424302Forward-GGCCATCGCCGGAAA Reverse-GGTTAATTTGCAGCGGCTAGTG Reverse-GTTGTTGCCATAGGAACATGGA. All Rights Reserved.170㊀生态毒理学报第16卷续表1基因Gene登记号Accession No.引物序列(5 ~3 )Sequence of the primer(5 ~3 )star NM_131663Forward-GGTCTGAGGAAGAATGCAATGAT Reverse-CCAGGTCCGGAGAGCTTGTcyp11a NM_152953Forward-GGCAGAGCACCGCAAAA Reverse-CCATCGTCCAGGGATCTTATTG3βhsd AY279108Forward-AGGCACGCAGGAGCACTACT Reverse-CCAATCGTCTTTCAGCTGGTAAcyp17AY281362Forward-TCTTTGACCCAGGACGCTTT Reverse-CCGACGGGCAGCACAA17βhsd AY306005Forward-TGCATCTCGCATCAAATCCA Reverse-GTCCAAGTTCCGCATAGTAGCAcyp19a1a AF226620Forward-GCTGACGGATGCTCAAGGA Reverse-CCACGATGCACCGCAGTAgr EF567112Forward-TTCTACGTTGCTGACGATGC Reverse CCGGTGTTCTCCTGTTTGATmr EF567113Forward-ATTGGGCCTAGTGCAAAATG Reverse-TCTCTGTTTGGCTCGGTCTTmc2r NM_180971Forward-CTCCGTTCTCCCTTCATCTG Reverse-GCAGATCCTTGAAGCTGAGGcrh NM_001007379Forward-TTCGGGAAGTAACCACAAGC Reverse-CTGCACTCTATTCGCCTTCCcrhr2XM_681362Forward-CCCAGTAAAGGCAGAAGCAC Reverse-CCCAGTAAAGGCAGAAGCACcrhbp NM_001003459Forward-TTTTTCATCGGCGAACCTAC Reverse-ACGATTGGTCGAGACACTCCpomc AY158003Forward-AGGTCGACTATCCGCAAGAA Reverse-CAACCTCTCCCCCTTAAAGCrpl8NM_200713Forward-TTGTTGGTGTTGTTGCTGGT Reverse-GGATGCTCAACAGGGTTCATtshb AY135147Forward-GCAGATCCTCACTTCACCTACC Reverse-GCACAGGTTTGGAGCATCTCAtshr NM_001145763Forward-GCTCCTTGATGTGTCCGAAT Reverse-CGGGCAGTCAGGTTACAAATtg XM_001335283Forward-CCAGCCGAAAGGATAGAGTTG Reverse-ATGCTGCCGTGGAATAGGAdiol BC076008Forward-GTTCAAACAGCTTGTCAAGGACT Reverse-AGCAAGCCTCTCCTCCAAGTTdio2NM_212789Forward-GCATAGGCAGTCGCTCATTT Reverse-TGTGGTCTCTCATCCAACCAttr BC081488Forward-CGGGTGGAGTTTGACACTTT Reverse-GCTCAGAAGGAGAGCCAGTAthra NM_131396Forward-CTATGAACAGCACATCCGACAAGAG Reverse-CACACCACACACGGCTCATCnis NM_001089391Forward-GGTGGCATGAAGGCTGTAAT Reverse-GCCTGATTGGCTCCATACATtrh NM_001012365Forward-CACACAGATGGAGGAGCAGA Reverse-AGCAGCATCAGGTAGCGTTTthrb NM_131340Forward-TGGGAGATGATACGGGTTGT Reverse-ATAGGTGCCGATCCAATGTCtrhr1NM_001114688Forward-CTGGTGGTGGTCAACTCCTT Reverse-GCTTTCCACCGTTGATGTTT. All Rights Reserved.第3期杨倩等:双酚F对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究171㊀1.3.6㊀数据处理由于所测定的不同激素浓度水平差别较大㊁单位不同,因此ELISA的数据采用相对于空白对照组的变化倍数来表示㊂激素水平的改变倍数为BPF 处理组相对于空白对照组改变的倍数;实时荧光定量PCR的调控倍数是以管家基因β-actin作为内参基因,以空白对照组进行标准化,采用2-әәC T方法计算所得[22]㊂采用IBM SPSS9进行统计学分析㊂基因转录水平在暴露组和空白对照组之间的差异性运用单因素方差分析㊂当P<0.05表示暴露组与对照组之间具有显著性差异㊂2㊀结果(Results)2.1㊀暴露溶液中BPF的实际浓度分析在暴露期间,空白对照中的BPF浓度低于检出限;BPF在试验开始时(0h)和换水前(24h)的实测浓度均无较大差异,并且所有实测浓度都非常接近所设置的名义浓度(表2),这说明BPF在胚胎暴露实验中浓度保持相对稳定㊂为了方便叙述,所有暴露浓度均以所设置的名义浓度来表示㊂2.2㊀BPF对斑马鱼早期胚胎发育的影响BPF暴露对斑马鱼胚胎的孵化率㊁存活率和畸形率的影响如表3所示㊂与空白对照组相比,100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1BPF暴露显著降低了胚胎的孵化率和存活率,而1000μg㊃L-1的BPF暴露使斑马鱼胚胎/仔鱼的畸形率显著升高㊂BPF导致的斑马鱼发育异常情况主要包括发育延迟㊁卵凝结㊁心包水肿和脊柱弯曲等情况(图2)㊂之前的研究报道表明,多种双酚A类化合物,如BPA㊁BPAF㊁四溴双酚A(tetrabromobisphenol A,TBBPA)和四氯双酚A (tetrachlorobisphenol A,TCBPA),均会对斑马鱼胚胎/仔鱼产生类似的发育损伤[23-25]㊂2.3㊀BPF暴露对激素水平的影响斑马鱼胚胎/仔鱼暴露于不同浓度的BPF中至受精后144h,对甲状腺激素㊁性激素和肾上腺糖皮质激素的影响如图3所示㊂其中,100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1的BPF导致T4水平分别为对照组的0.68倍和0.43倍,呈显著降低趋势;而T3的水平显著升高,分别是对照组的1.46倍和1.78倍㊂10㊁100和1000μg㊃L-1的BPF暴露组的性激素E2水平分别为对照组的1.37倍㊁1.57倍和1.82倍,显著高于对照组;而T的水平分别为对照组的0.71倍㊁0.62倍和0.51倍,呈显著降低的趋势;在100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1浓度下,C水平也显著性降低,分别为对照组的0.68倍和0.57倍㊂表2㊀暴露过程中BPF的名义浓度和实测浓度Table2㊀The nominal and measured concentrations of BPF暴露时间/h Exposure time/hBPF浓度/(μg㊃L-1)Concentration of BPF/(μg㊃L-1)011010010000LOD0.87ʃ0.5810.87ʃ1.7996.31ʃ8.82930.26ʃ73.7924LOD0.83ʃ0.4610.24ʃ1.6698.25ʃ6.53908.33ʃ85.58平均值Average LOD0.85ʃ0.5210.56ʃ1.7397.28ʃ7.68919.30ʃ79.69注:LOD表示最低检出限㊂Note:LOD stands for limit of detection.表3㊀BPF暴露144h对斑马鱼孵化率㊁存活率和畸形率的影响Table3㊀Hatching rates,survival rates and malformation rates of zebrafish after BPF exposure for144hBPF浓度/(μg㊃L-1)Concentration of BPF/(μg㊃L-1)01101001000孵化率/%Hatching rate/%98.33ʃ2.8995.00ʃ5.0091.67ʃ2.8988.33ʃ2.89*85.00ʃ5.00*存活率/%Survival rate/%98.33ʃ2.8995.00ʃ5.0091.67ʃ2.8986.67ʃ2.89*83.33ʃ2.89*畸形率/%Malformation rate/% 1.67ʃ2.890 5.36ʃ5.267.52ʃ3.1113.64ʃ2.64*注:*表示暴露组与对照组之间具有显著性差异(P<0.05)㊂Note:*indicates significant difference from the control(P<0.05).. All Rights Reserved.172㊀生态毒理学报第16卷图2㊀BPF 暴露下斑马鱼胚胎/仔鱼在不同发育阶段的发育损伤注:所有图片均放大20倍;(a)正常发育胚胎(空白对照组,受精后48h);(b)正常发育胚胎(空白对照组,受精后96h);(c)正常发育胚胎(空白对照组,受精后120h);(d)心包水肿胚胎(10μg ㊃L -1BPF ,受精后48h);(e)脊柱弯曲仔鱼(100μg ㊃L -1BPF ,受精后96h);(f)心包水肿仔鱼(100μg ㊃L -1BPF ,受精后120h);(g)心包水肿胚胎(1000μg ㊃L -1BPF ,受精后48h);(h)心包水肿仔鱼(1000μg ㊃L -1BPF ,受精后96h);(i)脊柱弯曲仔鱼(1000μg ㊃L -1BPF ,受精后120h)㊂Fig.2㊀Developmental toxicity of BPF on zebrafish embryos/larvae during the exposure periodNote:All images are shown at ˑ20;(a)Normal development of embryos (control group,48hpf);(b)Normal development of larvae (control group,96hpf);(c)Normal development of larvae (control group,120hpf);(d)Edematous development ofembryos (10μg ㊃L -1BPF,48hpf);(e)Larvae with a malformed trunk (100μg ㊃L -1BPF,96hpf);(f)Edematous development of larvae (100μg ㊃L -1BPF,120hpf);(g)Edematous development of embryos (1000μg ㊃L -1BPF,48hpf);(h)Edematous development of larvae (1000μg ㊃L -1BPF,96hpf);(i)Larvae with a malformed trunk (1000μg ㊃L -1BPF,120hpf).图3㊀BPF 暴露对斑马鱼胚胎/仔鱼的HPT 、HPG 和HPA 轴相关激素水平的影响注:T4表示甲状腺素,T3表示三碘甲状腺原氨酸,E2表示17β-雌二醇,T 表示睾酮,C 表示类固醇皮质醇;结果以3次重复的平均值ʃSD 表示,*表示暴露组与对照组之间具有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.3㊀Effects of BPF on hormone levels of HPT,HPG andHPA axes in zebrafish embryos/larvaeNote:T4stands for thyroxine;T3stands for triiodothyronine;E2standsfor 17β-estradiol;T stands for testosterone,C stands for cortisol;the results are shown as mean ʃSD of three replicates;asteriskindicates significant difference from control (P <0.05).2.4㊀BPF 暴露对斑马鱼胚胎/仔鱼HPT ㊁HPG 和HPA 轴相关基因表达的影响鱼类的甲状腺激素㊁性激素和皮质醇激素主要是通过内分泌系统HPT ㊁HPG 和HPA 轴控制的,通过内分泌轴上一系列基因的调节来维持激素的合成和平衡,而激素水平通过正㊁负反馈调节内分泌轴上各部分的功能,从而完成整个生长发育和繁殖过程㊂因此通过检测HPT ㊁HPG 和HPA 轴上的基因表达水平,可以进一步揭示BPF 的内分泌干扰效应及其作用机制㊂与空白对照组相比,BPF 所有处理组(1㊁10㊁100和1000μg ㊃L -1)分别导致HPT 轴thr α和trhr1基因表达水平的显著上调(分别上调1.61倍㊁1.78倍㊁1.99倍㊁1.93倍和1.65倍㊁2.76倍㊁2.20倍㊁1.66倍);10μg ㊃L -1以上浓度组的BPF 使trh 的表达水平显著降低,分别为空白对照组的0.35倍㊁0.32倍和0.09倍;在100μg ㊃L -1和1000μg ㊃L -1BPF 暴露下,tsh β的表达水平显著上调至1.83倍和1.87倍,tshr显著上调至2.26倍和4.29倍,dio1显著上调至1.45倍和2.07倍,dio2的基因表达水平显著性上调至2.48倍和2.79倍,而nis 的转录水平显著性下调至对照组的0.52倍和0.37倍(图4(a))㊂与空白对照组相比,暴露于10μg ㊃L -1以上浓度的BPF 时,HPG 轴基因cyp19a1b ㊁fsh β㊁fshr 和lh β的水平显著性上调,其中在10μg ㊃L -1时,分别上升至对照组的2.62倍㊁1.79倍㊁1.56倍和1.52倍;100. All Rights Reserved.第3期杨倩等:双酚F对斑马鱼早期生命阶段内分泌干扰效应研究173㊀μg㊃L-1和1000μg㊃L-1浓度暴露后,erα的基因表达水平分别上升至1.37倍和1.64倍㊁gnrh2上调至1.87倍和1.56倍㊁gnrh3上升至1.52倍和1.83倍㊁cyp11a上升至1.92倍和1.62倍㊁cyp19a1a上升至1.66倍和1.88倍㊁lhr的基因表达水平上调至1.48倍和1.68倍;而cyp17的表达水平分别下调至0.72倍和0.52倍;只有1000μg㊃L-1的BPF暴露使gn-rhr2的表达水平显著性升高(为空白对照组的1.79倍),17βhsd的表达水平显著下调(为空白对照组的0.65倍)(图4(b))㊂BPF暴露后,4个浓度组(1㊁10㊁100和1000μg ㊃L-1)均使HPA轴crh和mc2r的基因表达水平显著上调(分别上调1.98倍㊁2.86倍㊁4.71倍㊁6.92倍和1.71倍㊁1.85倍㊁1.56倍㊁2.14倍);10μg㊃L-1以上浓度的BPF导致pomc基因表达水平分别上调2.04倍㊁2.38倍和1.96倍,与对照组具有显著性差异;100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1浓度组显著提高了mr的表达水平,分别为空白对照组的1.85倍和2.83倍(图4(c))㊂图4㊀BPF暴露对斑马鱼胚胎/仔鱼HPT、HPG和HPA轴相关基因表达水平的影响注:(a)HPT轴;(b)HPG轴;(c)HPA轴;结果以3次重复的平均值ʃSD表示,*表示暴露组与对照组之间具有显著性差异(P<0.05)㊂Fig.4㊀Gene expression of the HPT,HPG and HPA axes in zebrafish embryos/larvae exposed to BPFNote:(a)HPT axis;(b)HPG axis;(c)HPA axis;the results are shown as meanʃSD of three replicates;asterisk indicates significant difference from control(P<0.05).. All Rights Reserved.174㊀生态毒理学报第16卷3㊀讨论(Discussion)BPF对斑马鱼HPT㊁HPG和HPA轴的影响及其交互作用如图5和图6所示㊂鱼类甲状腺滤泡主要分泌甲状腺激素T4以及少量的T3㊂T4与血液中的运载蛋白结合后,脱去一个碘原子,转化为T3㊂在鱼类的早期生命阶段,甲状腺系统在其正常的生长发育中发挥着重要的调控作用㊂一些化合物能够通过干扰甲状腺激素的合成㊁转运和代谢等过程,引起甲状腺激素水平的紊乱,进而影响生物体的生长㊁发育和繁殖等生理过程㊂本研究中,BPF对斑马鱼胚胎暴露至受精后144h,低浓度组并未对甲状腺激素产生影响,但是2个高浓度组均使仔鱼体内T3水平显著升高,T4水平显著降低,说明BPF能影响斑马鱼甲状腺激素的水平,具有甲状腺系统内分泌干扰效应㊂性激素包括雌激素和雄激素,可以促进性器官和第二性征的发育,并维持其功能㊂雌二醇是硬骨鱼体内含量最高的雌激素,而睾酮是含量最高也是最重要的雄激素,测定鱼类体内性激素水平的变化情况可以用来筛选环境内分泌干扰物[26]㊂在本研究中,暴露于10㊁100和1000μg㊃L-1的BPF均导致仔鱼体内睾酮水平的显著性下调,以及雌二醇水平的显著性上调㊂当雄激素水平降低,雌激素水平升高时,鱼类雄性特征的发育和维持将会受到影响,因此BPF对斑马鱼胚胎/仔鱼都具有一定的雌激素效应㊂研究发现,当鱼类长时间暴露于环境中污染物时,将导致HPA轴受损,肾间腺 疲惫 ,皮质醇水平降低[27]㊂本研究中,100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1的BPF导致类固醇皮质醇水平的降低,与其他学者的研究结果一致㊂甲状腺激素水平受HPT轴的调控,内分泌干扰物可以通过作用于HPT轴,干扰HPT轴作用位点,破坏甲状腺激素平衡,从而对生长发育造成一系列的危害㊂TRH和促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)的分泌在鱼类HPT轴上的调节作用会因为循环系统中的甲状腺激素水平发生变化而变化,因此可以通过检测促甲状腺激素tshβ基因转录水平的变化来评估环境化合物是否会引起甲状腺功能紊乱,进而阐明化合物扰乱甲状腺功能的作用机制㊂已有的研究报道证明,在鱼类中T3和T4能够通过负反馈机制调节tshβ的基因表达[27-32]㊂在本研究中,BPF暴露后,tshβ和受体tshr的转录水平均显著性提高,可能是由于T4水平的降低而引起的反馈调节机制所导致的㊂在BPF暴露后的仔鱼中,trh基因的表达受到了抑制,与tshβ基因上调的变化相反,可能的原因是促甲状腺激素释放激素除了能够调控甲状腺轴外,还可以促进垂体分泌α-促黑激素[33],以及调控摄食等[34]㊂因此,本文BPF使trh基因的转录水平下调,可能并不只是其对HPT轴的影响所致㊂钠/碘转运体蛋白(Na+/I-symporter,NIS)将碘从血液中运输到甲状腺滤泡细胞,是甲状腺激素合成的第一步[35]㊂甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)是甲状腺激素的前体蛋白,被甲状腺用于合成甲状腺激素T3和T4[36]㊂因此nis和tg基因转录水平的变化可能对甲状腺激素的浓度有影响㊂脱碘酶(DIO)的主要功能是将T4转换成T3㊂斑马鱼体内有2种类型的脱碘酶,DIO1和DIO2㊂BPF对斑马鱼胚胎/仔鱼暴露144h后,nis基因的表达水平显著性下调,可能导致T4的合成受阻,而dio1和dio2的表达水平均显著升高,导致T4向T3的转化速率加快,这可能是T4水平下降㊁而T3水平升高的原因㊂有研究将脱碘酶基因表达水平的高低作为评价甲状腺干扰的标志物[37],这进一步证明了BPF对斑马鱼胚胎/仔鱼具有甲状腺激素干扰效应㊂甲状腺激素通过与受体结合起作用㊂Chen等[29]发现T3浓度水平的升高会引起甲状腺激素受体基因表达的上调,并影响到甲状腺轴上其他基因的转录水平㊂BPF暴露诱导了thrα表达水平的上调,thrβ基因转录水平却均未发生明显的变化㊂Thrα和thrβ结构的异常可能会导致甲状腺激素不能与受体结合和激活相应的受体后的级联反应的发生,已有的一些研究也报道了斑马鱼仔鱼经化学品暴露后thrα和thrβ的变化不一致的现象[28-29],因此推测thrα和thrβ可能作用于不同的功能区,对甲状腺激素的生理功能具有不同的作用㊂性激素的水平主要受HPG的调控,通过HPG 轴上一系列基因的调节来维持性激素的合成和平衡,从而完成整个生殖过程㊂斑马鱼胚胎暴露于BPF之后,导致斑马鱼下丘脑和垂体中gnrh和gn-rhr㊁促性腺激素fshβ㊁lhβ以及受体fshr和lhr基因表达水平显著性提高,这可能会促进类固醇激素的合成和分泌㊂促卵泡激素(follicle stimulating hor-mone,FSH)㊁促黄体激素(luteinizing hormone,LH)的浓度与甲状腺激素的浓度呈负相关[12],本文观察到的促性腺激素及其受体的基因表达水平升高也可能是由降低的T4水平引起的,以促进类固醇激素的生成㊂P450是将雄激素催化转化为雌激素的关键限. All Rights Reserved.。
斑马鱼在研究基因与行为关系中的应用
斑马鱼在研究基因与行为关系中的应用随着科学技术的发展，研究基因与行为的关系成为了一个备受瞩目的研究领域。
而在这个领域中，斑马鱼成为了一种非常有价值的研究对象。
因为斑马鱼的基因组非常简单，而且它们的行为也非常容易进行观察。
下面，我将会为大家介绍一下斑马鱼在研究基因与行为关系中的应用，希望大家可以从中受到一定的启发。
一、斑马鱼的基因组非常简单斑马鱼是一种小鱼，在成长过程中它们的体型也不会发生太大的变化。
因此，它们需要的基因数量就比人类和其他动物要少很多。
事实上，斑马鱼只有25,000组基因，这比人类的基因数量要少很多。
这也就意味着，对斑马鱼基因的研究要比对人类基因的研究更为简单，从而可以更加高效地进行研究。
二、斑马鱼的行为容易进行观察斑马鱼生活在淡水中，而且它们不会闲着，往往会在水里来回来去、寻找食物或者寻找伴侣。
因此，人们可以通过观察斑马鱼的行为来判断它们是否存在一些行为特征，这些行为特征可能与其基因有关。
比如，我们可以通过观察斑马鱼的行为来判断，某个突变基因是否会对斑马鱼的运动能力产生影响。
三、斑马鱼的研究成果非常有价值在对斑马鱼进行研究的过程中，科学家们已经发现了很多与基因和行为相关的信息。
比如，他们发现斑马鱼的基因组中包含的几乎所有人类基因的变种，包括那些与我们的神经系统、免疫系统和代谢系统相关的基因。
同时，斑马鱼的大脑也非常适合进行研究。
这是因为，斑马鱼的大脑发育得非常迅速，在它们出生后的短短几天内，它们就会具备一些非常重要的属性，比如可以记忆一些简单的信息。
利用这些对斑马鱼进行的研究成果，科学家们可以进一步了解人类大脑和神经系统等复杂系统的运作方式。
四、斑马鱼的研究有助于疾病的治疗目前，一些科学家已经开始试图利用斑马鱼进行一些疾病模型的研究。
比如，他们已经利用斑马鱼成功地研究了如何治疗心脏病、癌症和神经退行性疾病等。
这是因为，斑马鱼的生命周期非常短，同时它们的产卵也非常容易进行控制。
也就是说，科学家们可以非常简单地进行大规模的基因型分析。
福美双对斑马鱼胚胎Ⅲ型脱碘酶基因表达的影响
，
ｎｅ ｔ Ｍ ｏ ｎｇｏｌ ｉ ａ Ｕｎｉ ｖｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏｒ ｆ Ｎａ ｔ ｉ ｏｎａ ｌ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ，ＴｏｎｇＬｉ ａ ｏ ０ ２ ８ ０ ４ ２，Ｃｈｉ ｎａ ２．Ｃｏｌ ｌ ｅ ｇｅ ｏｆ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎｃ ｅ ｓ， Ｉ ｎｎｅ ｒ Ｍ ｏｎｇ ｏｌ ｉ ａ Ｕｎｉ ｖｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏｒ ｆ Ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎａ ｌ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ，ＴｏｎｇＬｉ ａ ｏ ０ ２８ ０ ０ ０，Ｃｈｉ ｎａ
２ ０ １ ５年 第 １ ０卷 第 ２期 ， ３ ２ ０ — ３ ２ ４
生
态
毒
理 学
报
Ｖｏ１ ．１ ０， ２ ０１ ５ Ｎｏ． ２ ．３ ２ ０ — ３ ２ ４
Ａｓ ｉ ａ ｎ Ｊ ｏ ｕｒ ｎａ ｌ ｏｆ Ｅ ｃ ｏ ｔ ｏ ｘ ｉ ｃ ｏｌ ｏ ｇｙ
ＤｏＩ ： １ ０ ． ７ ５ ２ ４ ／ ＡＪ Ｅ． １ ６ ７ ３ － ５ ８ ９ ７２ ０ １ ４ ０ ６ ２ ７ ０ ０ｌ
文章 编 号 ：１ ６ ７ ３ — ５ ８ ９ ７ （ ２ ０ １ ５ ） ２ － ３ ２ ０ － ０ ５ 中图 分 类 号 ： Ｘ１ ７ １ ＿ ５ 文 献标 识码 ： Ａ
利用微卫星标记分析三个品系斑马鱼的遗传多样性
利用微卫星标记分析三个品系斑马鱼的遗传多样性傅炳元;郑晓姿;余佳佳;邵晓雨;曹访;采克俊【摘要】利用4个斑马鱼微卫星分子标记,对3个品系(AB品系、LF品系、TU品系)的斑马鱼进行遗传多样性和系统发生关系分析.研究结果显示:斑马鱼种水平的Shannon信息指数(Ⅰ)为0.5647,平均为0.4479,基因多样性指数(H)为0.3830,平均为0.3033,表明斑马鱼品系内及品系间均具有较高的遗传多样性.斑马鱼品系间的基因分化系数(G)和基因流(Nm)分别为0.2081、1.9026,斑马鱼3个品系间的遗传距离平均为0.1890.并以聚类分析和群体结构分析为基础,将3个品系斑马鱼分为2个支系:AB品系斑马鱼和TU品系斑马鱼为第1支系,LF品系斑马鱼为第2支系.【期刊名称】《湖州师范学院学报》【年(卷),期】2012(034)002【总页数】6页(P31-36)【关键词】微卫星;遗传多样性;斑马鱼;品系【作者】傅炳元;郑晓姿;余佳佳;邵晓雨;曹访;采克俊【作者单位】湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000;湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000;湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000;湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000;湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000;湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000【正文语种】中文【中图分类】G959.4830 引言斑马鱼（Danio rerio）具有个体小易养殖、性成熟周期短、繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明等诸多优点，再加上斑马鱼基因组测序工程的完成和其基因与人类基因高度的相似性［1］，使得斑马鱼已成为一种重要的模式脊椎动物，并且广泛地用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究.斑马鱼品系资源丰富，除了野生型品系之外，目前研究人员已经开发出3000多个斑马鱼突变品系和200多个转基因斑马鱼品系.这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用.然而，斑马鱼品系的迅速增加不可避免地带来了品系混杂和不易鉴别的难题.因此，开展斑马鱼的遗传多样性水平的研究，建立斑马鱼品系鉴别体系，对斑马鱼品系资源的保护和合理利用具有重要意义.由于微卫星分子标记广泛分布于真核生物的基因组中［2］，按照孟德尔方式分离，呈共显性遗传，多态性丰富，稳定性较好，引物通用性强［3］，操作简单，应用结果准确有效［4］，其已被作为重要的分子遗传标记应用于品系资源分类及遗传多样性的评估中.目前，有人利用斑马鱼不同染色体上的3个微卫星位点对常用的4种近交系斑马鱼进行了微卫星DNA多态性分析，还有人利用5对斑马鱼STR引物和3对剑尾鱼STR引物对3个封闭群斑马鱼进行STR遗传检测.对不同品系斑马鱼进行STR分析的报道并不多见.本实验对斑马鱼的三个品系进行了遗传多样性的研究，试图从分子水平上为斑马鱼品系确定和类型划分提供分子遗传学依据，为斑马鱼品系资源保护提供理论基础，并为进一步培育新的斑马鱼品系提供基础资料.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 斑马鱼本实验所用的鱼为从上海燕雪热带鱼养殖厂购得的AB、TU、LF三个品系斑马鱼，其中AB品系为青色，体长4～5cm；TU品系为红色短鳍，体长3～4cm；LF品系为红色长鳍，体长3～4cm，各品系内斑马鱼日龄相近，并且各自的表型也相对一致.先将分多批购买的100条相同品系斑马鱼混养，再分别从各自品系中随机挑选出30条健康的斑马鱼作为实验材料.1.1.2 试剂蛋白酶k、rTaq、dNTP、DNA Marker、6×Loading buffer、10×PCR buffer、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、N，N’－亚甲基双丙烯酰胺、硝酸银等均购自Takara公司.1.1.3 引物根据魏杰等［5］和穆苑［6］报道，从多对微卫星引物序列中筛选出z9384、z4299、z7382和z20046四对斑马鱼微卫星引物，由上海Invitrogen公司合成.微卫星引物的序列及退火温度见表1.表1 4个微卫星引物序列及退火温度引物序列退火温度／℃z4299 F：AGGAATGCGCTATGGGACGA R：CACATCTGCCACTGAACCGG 58 z3782 F：AATTCTGGGGGGTAATTCTGGC R：AAGGGGGCTAAACCTTCAACTG 61z9384 F：CCGACTGGAGAAGACCTGAG R：AGCATAATCAGACAACCGGG 57 z20046 F：TTCAGGTTTAAGGTTATAAAAACGA R：AACCAATATGTCATGGCATCC 551.2 方法1.2.1 基因组DNA的提取挑取3个品系斑马鱼各30尾，解剖取得0.2g斑马鱼肌肉组织，用标准酚－氯仿、酒精沉淀的方法提取基因组DNA：将剪碎的肌肉加入6μL蛋白酶k，55℃保温12h以上，消化过夜；加等体积酚抽提1～2次；再用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提1次；预冷无水乙醇沉淀；最后用75%乙醇洗涤并干燥后加入TE溶解；置于4℃ 冰箱内保存备用.1.2.2 微卫星PCR扩增检测用所选的4对斑马鱼微卫星引物分别进行扩增.PCR扩增体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，10mM dNTPs 2μL，5U／μL Taq DNA聚合酶0.3μL，10μM 的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O17.2μL.反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性20s，58℃ 复性20s，72℃延伸40s，共进行35个循环，最后72℃下延伸7min.产物置于4℃ 冰箱内保存.PCR产物经15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显带，待凝胶晾干后进行拍照.1.2.3 数据处理及分析对各品系清晰的条带图谱进行比较，以矩阵形式将数据进行统计并运用POPGEN 32（version 1.32）软件计算得出Shannon指数（I）、Nei基因多样性（h），以及各品系间遗传相似度和Nei氏标准遗传距离，利用PIC＿CALC小软件计算多态信息含量.用MEGA 4.0软件对标准遗传距离采用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析.1.2.3.1 多态信息含量（PIC ）多态信息含量是表示微卫星DNA变异程度高低（微卫星座位多态性）的一个指标.式中Pi、Pj分别为群体中第i、j个等位基因频率，n为等位基因个数.高度多态性座位的PIC值大于0.5；低度多态性座位的PIC值小于0.25；中度多态性座位的PIC值在0.25和0.5之间.PIC和H都能反映群体内个体遗传变异的程度，数值高说明遗传变异就大，反之则群体内的遗传变异小［7］.1.2.3.2 Shannon信息指数（I）I＝－∑XiLnXi.其中，Xi为位点i在某一群体中的出现频率.以上分析采用POPGEN Version1.32软件进行统计，用AMOVA进行遗传变异方差分析，对以上指标进行显著性检验.1.2.3.3 Nei基因多样性（H）H＝1－∑X2i.1.2.3.4 遗传相似度和 Nei氏标准遗传距离（Nei’s genetic distance，Ds）式中：Ds为标准遗传距离，Xij、Yij为群体X、Y中第r个位点上第k个等位基因的频率，n为检测的位点数［8］.2 结果与分析2.1 多态信息含量（PIC）多态信息含量（PIC）是在连锁分析中一个遗传标记多态性可提供的信息量的度量［9］，在此也可表示为微卫星DNA变异程度的一个指标，反映微卫星多态性的高低.从表2可知，本实验研究的3个微卫星座位z3782、z4299、z9384在AB、LF、TU三个品系斑马鱼上所获得的平均多态信息的含量分别为0.2706、0.3425和0.2369.根据Bostein等提出的多态信息含量指标，0.2706和0.3425分别都落在（0.25、0.5）内，z3782和z4299为中度多态座位；而0.2369落在了（0、0.25）内，z9384为低度多态座位，即z3782和z9384微卫星座位能提供较合理的信息，z9384只能提供较少的信息.表2 3个微卫星座位的多态信息含量（PIC）位点z3782 0.2706位点多态信息含量（PIC）中度多态位点z4299 0.3425 中度多态位点z9384 0.2369低度多态位点2.2 遗传多样性利用4个微卫星引物对斑马鱼3个品系共90个个体的DNA样本进行SSR分析，除了z20046只能扩增个别个体的DNA且条带模糊外，其余3个引物z4299、z3782、z9384的扩增产物在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后均条带清晰（图1）.数据计算得到的Shannon信息指数（I）及Nei基因多样性（H）见表3.图1 微卫星z3782的PCR扩增产物非变性聚丙烯酰胺电泳图谱表3 3个微卫星座位的多态信息含量（PIC）品系样本数 Shannon信息指数（I）Nei基因多样性（H）0.1316 0.1152 AB 30 0.4818 0.3215 TU 30 0.5121 0.3478 LF 30 0.3498 0.2406种90 0.5647 0.3830平均＊＊＊ 0.44790.3033 SD（标准误）＊＊＊由表3可知，各品系的Shannon信息指数有一定差异，其中TU品系的Shannon信息指数最高，为0.5121；AB品系其次，为0.4818；LF品系最低，为0.3498.3个品系的I平均为0.4479，种水平的I为0.5647，Nei基因型多样性（H）种水平为0.3830，在3个品系中的大小顺序与I的大小顺序一致，其变化范围在0.2406到0.3478之间，平均水平为0.3033.由I和H都可解释斑马鱼在物种水平和各品系水平上均有很高的遗传多样性.2.3 遗传分化计算的基因多样性及遗传分化系数（见表4），种群内的基因多样性为0.3033，品系间遗传分化系数（Gst）为0.2081.品系内基因多样性所占比例为0.7919，显示斑马鱼品系的变异大部分来自品系内，小部分存在品系间.由Gst所估算的基因流为1.9026.表4 斑马鱼的基因多样性及遗传分化系数注：括号内的数据为标准误.数值种群内的基因多样性（Hs） 0.3033（0.0183）Nei基因多样性（H）1.9026种群总的基因多样性（Ht） 0.3830（0.0133）种群内基因多样性所占比例，Hs／Ht 0.7919遗传分化系数（Gst） 0.2801基因流Nm2.4 遗传距离利用POPGENE软件计算3个品系间的遗传相似度和遗传距离的结果见表5.由表3可知，3个品系的平均遗传相似度为0.8316，平均遗传距离为0.1890.AB与TU的遗传距离最小，为0.1128；LF与TU的遗传距离也较小，为0.1282；AB与LF 的遗传距离最大，为0.3261.根据斑马鱼品系间的遗传距离，采用UPGMA法对3个品系进行聚类，得到树状图（图2）.表5 3个斑马鱼品系间的遗传相似度和遗传距离品系0.8933 0.7218 TU 0.1128 ＊＊＊ 0.8796 LF 0.3261 0.1282 AB TU LF AB ＊＊＊＊＊＊图2 基于Nei’s遗传距离构建的3个品系斑马鱼的UPGMA聚类图3 讨论3.1 遗传距离遗传多样性一般遗传多样性是指狭义上，即种内不同群体和个体间的遗传多态性程度［10］.度量遗传多样性水平的常用指标有Nei基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）.本实验经过软件计算得到Nei基因多样性指数（H）和Shannon信息指数，AB品系分别为0.3215、0.4818；TU 品系分别为0.3478、0.5121；LF品系分别为0.2406、0.3498；种水平分别为0.3830、0.5647.由此得知斑马鱼的AB与TU品系具有较高的遗传多样性，且处于同一水平，而LF品系遗传多样性水平低于其他两者.这是LF品系在地域上有一定程度的隔离或保护，而AB和TU品系与其他品系间杂交现象严重，作为模式生物的斑马鱼在研究要求上将会为取材带来极大的麻烦，故应尽早建立纯系品种养殖基地，重视对纯系斑马鱼资源的保护和开发.魏杰等［5］采用STR引物扩增的方法分析不同种群在核酸水平上的异同，结果z20046群间差异显著（P＜0.01）及z9384有群间差异（P＜0.5）.穆苑利用微卫星引物z4299和z3782对四个近交系斑马鱼进行了微卫星多态性研究，结果3个微卫星DNA具有稳定扩增效果在不同品系之间表现显著多态性［6］.本实验采用前者的z20046、z9384、z4299和z3782共4对微卫星引物对斑马鱼AB、TU和LF进行扩增检测，结果是z20046扩增效果差，将其弃去.除去引物本身的缺陷，还可考虑到PCR条件是否成熟，其中退火温度尤为重要.PCR中降低退火温度可能增加扩增产量，但引物与模板间的错配现象也会增多，导致非特异性扩增上升［11］.经过数据处理，3对引物即z4299、z3782和z9384在AB、LF、TU三个品系斑马鱼上所获得的平均多态信息含量分别为0.2706、0.3425和0.2369.引物z4299和z3782都坐落在（0.25、0.5）内，均为中度多态座位，而z9384则坐落在（0、0.25）内，给出的信息更少，为低度多态座位.这与穆苑等［6］所得到的z4299和z3782有显著多态性的结果有所差异，而z9384体现的多态性和魏杰［5］的结果基本一致.3.2 品系间亲缘关系比较遗传相似性指数和遗传距离是衡量群体间亲缘关系的重要指标［12］.Crawford等［13］指出，若要保存尽量多的遗传多样性，必须有可靠的方法对品种间的遗传分化进行测定，利用微卫星标记的方法将其数据计算所得的遗传距离能够反映分化时间的长短，更能客观地反映本实验中品系间的遗传变异和分化.本实验计算所得结果如下：AB与TU品系的遗传相似性指数及遗传距离分别为0.8933、0.1128；AB与LF品系间分别为0.7218、0.3261；TU 和LF品系间分别为0.8796、0.1282.若个体间遗传相似性指数大于0.5，则为一级亲缘关系；若遗传相似性指数在（0.25，0.5），则为二级亲缘关系.由图2可知，AB与TU品系的分化时间较早，两者与LF品系的分化时间较长.由遗传距离和聚类图可知，AB和TU品系聚为一类，再与LF品系聚到一起.AB与TU品系的遗传分化较小，但3个品系的遗传相似性指数都大于0.5，为一级亲缘关系.这一现象的可能原因是3个品系来源于同一个野生祖先，而最早分化的是LF品系.而AB和TU品系的分化时间可能在同一时期，也可能是被人为诱变的同时期产物.这一想法与美国哈佛大学Wolfgang Driever博士的研究组对斑马鱼进行大规模化学诱变研究，到1996年他们共鉴定出约4000多种斑马鱼突变体，并将Tuebingen品系、AB品系、WIK品系作为研究主要品系不谋而合.而且，斑马鱼基因组计划的所用品系就是Tuebingen品系［1］.3.3 微卫星分子标记微卫星作为一种分子遗传标记，拥有较高的个体特异性和可重复性，还能够提供丰富的多态位点及基因座位杂合度和纯合度的遗传信息［14］，故而广泛地应用于群体遗传多样性研究、遗传作图、品种鉴定和群体进化等诸多研究领域.利用微卫星标记也可以分析鱼类的遗传多样性，了解群体间的遗传变异程度，进行群体归类［15，16］；还可以通过分析遗传结构、遗传距离等数据，筛选和培育出具有优良性状的新品种（如耐高温、耐盐性、繁殖力强、生长旺盛等）.本实验利用微卫星标记对3个品系斑马鱼进行了遗传多样性的分析，计算遗传距离，区分了3个品系在遗传上的差别，进行聚类分析后，最终将其分成2个支系，此方法便捷，准确性高，可为后续更多的新的斑马鱼品系的鉴别和归类提供依据，也为斑马鱼品系资源的保护和合理利用奠定基础.参考文献：［1］孙智慧，贾顺姬，孟安明.斑马鱼：在生命科学中畅游［J］.生命科学，2006，8：431～436.［2］徐莉，赵桂仿.微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用［J］.西北植物学报，2002，22：714～722.［3］张小谷，童金苟，熊邦喜.微卫星标记在鱼类遗传及育种研究中的应用［J］.农业生物技术学报，2006，16：117～121.［4］储明星，王吉振，王爱国，等.小尾寒羊五个微卫星基因座遗传多态性研究［J］.遗传学报，2002，29：502～505.［5］魏杰，王洪，马丽颖，等.封闭群斑马鱼的STR遗传检测技术［J］.中国比较医学杂志，2009，19：70～75.［6］穆苑，孙德明.四个近交系斑马鱼微卫星多态性研究［J］.实验动物科学，2010，27：27～30.［7］乔利英，袁亚男.微卫星标记遗传多样性的度量指标及影响因素［J］.中国畜牧兽医，2010，37（1）：107～111.［8］Nei M，Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1979，76：5269～5273.［9］王长忠，李忠，梁宏伟，等.长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析［J］.生物多样性，2009，17：518～523.［10］李国庆，伍育源，秦志峰，等.鱼类遗传多样性研究［J］.水产科学，2004，23：42～44.［11］黄银花，胡晓湘，徐慰倬，等.影响多重PCR扩增效果的因素［J］.遗传，2003，25：65～68.［12］陈万光，王慧.2个锦鲤人工养殖群体遗传多样性的微卫星标记分析［J］.水生态学杂志，2009，2（1）：45～48.［13］Crawford A M，Little Pohn R P.The use of DNA marker in deciding conservation priorities in sheep and other live stock［J］.Animal Genetic Resources Information，1998，23：2～26.［14］Desvignes J F，Laroche J，Durand J D.Genetic variability in reared stocks of common Carp（Cyprinus carpio L）based on allozymes and microsatellites［J］.Aquaculture，2001，194：291～301.［15］董秋芬，刘楚吾，郭昱嵩，等.9种石斑鱼遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析［J］.遗传，2007，7：837～843.［16］刘臻，鲁双庆，匡刚桥，等.湘江野鲤养殖群体和自然群体遗传多样性的微卫星分析［J］.生态学杂志，2007，7：1074～1079.。
斑马鱼胚胎发育基因与功能的研究进展
斑马鱼胚胎发育基因与功能的研究进展斑马鱼是一种常见但又极其特殊的小型观赏鱼类，它们不仅长得漂亮，而且拥有极强的再生能力，因此成为了生物科学研究的重要模式生物。
通过对斑马鱼进行基因编辑和遗传学实验，科学家们逐渐发现其胚胎发育过程中涉及的各种基因以及它们的功能，这不仅可以加深我们对斑马鱼胚胎发育的认识，而且可以为其它生物的研究提供指导和借鉴。
一、斑马鱼基因组的研究斑马鱼的基因组非常小、简单，但也很特殊，与人类和小鼠基因组存在较高的相似性，这让斑马鱼成为了研究发育生物学、基因调控和疾病模型等领域的绝佳模式生物。
研究发现，斑马鱼基因组含有大约2.7亿个碱基对，并且有约7万个基因，其中的大部分基因与人类或小鼠的基因存在功能上的相似性。
这让斑马鱼成为了研究发育生物学、基因调控和疾病模型等领域的绝佳模式生物，因为它们的生长和发育具有很高的可塑性，而且在成年后生命周期较短，其胚胎的早期发育过程更是完全透明，让科学家可以清晰地观察到其中的过程。
二、斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控斑马鱼胚胎发育过程一般分为不同的阶段，通过对各个发育阶段的斑马鱼胚胎进行基因调控和功能研究，科学家们逐渐揭示了许多重要的发现。
一些基因负责斑马鱼的胚胎发育，如胚胎发育第一阶段的基因nrdp1，其担负着细胞核中的degradation保持during cell division的任务，同时nrdp1和内质网脱落调节蛋白p58温度缺陷包装的方式也有关系。
另一些基因则负责胚胎的器官发育，如在体育的鳍环投射被关键结构点抑制基因和smoothened 等基因，这些基因在斑马鱼胚胎发育过程中扮演着重要的角色，它们的异常活动会造成发育异常或者致病。
而在斑马鱼胚胎发育到一定的时期以后，神经系统的快速发育就成为了重点，这时候一些特异性的基因将会被表达，如gap43和omp等，这些基因机制是重要的神经信息人员通道的生物标志，此时会刺激生长锻炼和神经系统之间的联系，指导树突和神经纤维的生长与导向，如此就可以构建功能区域内的神经网络。
STAT3与斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生的相关性研究
STAT3与斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生的相关性研究[背景]顺铂是一种临床上广泛使用的抗肿瘤药物,具有细胞毒性,同时也具有耳毒性,能造成不可逆转的感音神经性耳聋。
既往研究发现,顺铂能直接导致耳蜗毛细胞的损伤缺失,并且损害血管纹细胞和螺旋神经节神经元。
目前尚没有一种药物可以有效预防或治疗毛细胞损伤或丢失导致的听力障碍。
毛细胞再生仍然是耳科学及听力学研究领域的难点和热点。
毛细胞发育和再生的过程受到多种分子机制的调控,包括Atoh1、Wnt、Notch、FGF、Shh等。
STAT3是JAK-STAT信号通路中的重要环节,在许多细胞和组织中都有表达,在调节细胞生长、分化、凋亡、血管生成、代谢及免疫反应等过程中发挥作用。
但STAT3在毛细胞再生过程中的作用尚未阐明。
斑马鱼基因与人类基因高度同源,其内耳毛细胞及侧线毛细胞均可自发再生。
斑马鱼侧线系统具有结构简单、操作容易、观察直观等特点,是一种研究毛细胞损伤及再生的理想模型。
有鉴于此,我们利用顺铂建立斑马鱼幼鱼侧线毛细胞损伤及再生模型,并进一步探究STAT3与斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生的相关性。
[目的]建立斑马鱼幼鱼侧线毛细胞损伤及再生模型;探究STAT3与斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生的相关性。
[方法](1)采用50μmol/L顺铂溶液处理受精后5天(5dpf)斑马鱼幼鱼24小时,以YO-PRO-1和FM1-43FX标记侧线毛细胞,显微镜下观察毛细胞损伤及再生情况。
(2)运用斑马鱼整体原位杂交技术检测STAT3基因在侧线毛细胞再生过程的表达。
(3)利用STAT3特异性抑制剂APTSTAT3-9处理顺铂损伤后的斑马鱼幼鱼,观察侧线毛细胞再生的变化情况。
[结果](1)以500μmol/L顺铂溶液处理受精后5天(5dpf)斑马鱼幼鱼24小时后,YO-PRO-1标记的毛细胞完全消失。
而撤除顺铂后6小时、12小时、24小时、48小时,FMI-43FX标记阳性的毛细胞随时间延长而显著增多。
lmo4b对斑马鱼脑发育和内耳形态学的影响研究
犾犿狅４犫 对斑马鱼脑发育和内耳形态学的影响研究
胡 旭，黄 炜，盛东来
（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江省器官发育与再生技术研究重点实验室，浙江 杭州，３１００３６）
摘 要：通过对转基因斑马鱼（ＥＧＦＰ 标记多巴胺神经细胞）进行胚胎显微注射犾犿狅４犫 ＭＯ，研究犾犿狅４犫 抑制 对其脑以及内耳形态发育的影响，结果表明犾犿狅４犫 抑制会 对 斑 马 鱼 脑 部 发 育 的 大 小 产 生 显 著 影 响，但 其 调 控 脑 部大小的作用与多巴胺神经细胞数量无显著相关；此外，犾犿狅４犫 抑制对斑马鱼内耳发育有明显的致畸作用．
关 键 词 ：斑 马 鱼 ；犾犿狅４犫；脑 ；内 耳 中图分类号：Ｑ３８ 文献标志码：Ａ 文 章 编 号 ：１６７４２３２Ｘ（２０１８）０２０１５３０６
大约７０％的人类疾病基因，在结构和功能上与斑马鱼高度相 似［１］，因 此 斑 马 鱼 作 为 模 式 动 物 的 一 种， 广泛应用于脊椎动物的基因表达和调控研究以及人 类疾 病、遗 传学和 生长 发 育 的 研 究。斑 马 鱼 的 发 育 非 常迅速，胚胎透明，易于显微操作和观察，另外斑马鱼荧 光染色、组织移 植 技 术、全 胚 组 织 标 本 制 作 及 全 胚 原位杂交技术均已成熟 。 ［２］ 斑马鱼所具有的独特优势让其成为研究脊柱动物形态发生、神经发育、药 物 筛 选和环境检测等领域的重要模型之一．
１５４
ห้องสมุดไป่ตู้
杭 州 师 范 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ）
２０１８ 年
１ 材料与方法
１．１ 实 验 材 料 及 试 剂 实验所用斑马鱼成体均为脑部 ＥＧＦＰ 标记多巴胺神经细胞的转基因品种（Ｔｇ（犇犪狋：犈犌犉犘））．斑马鱼
成体均统一生活在温度范围为２７－２９ ℃，ｐＨ 范围为６．０－７．５的人 工控 制水循 环系统中．实验 所用 斑马 鱼胚胎则是通过成体斑马鱼的自然交配获得．出生当天记为０天，出生 后１ 小时 为１ｈｐｆ，出生 后１天为 １ ｄｐｆ，以 此 类 推 ． １．１．１ 斑 马 鱼 培 养 试 剂
与斑马鱼线粒体相关的基因
与斑马鱼线粒体相关的基因
与斑马鱼线粒体相关的基因包括：
1. 线粒体DNA：斑马鱼的线粒体拥有自己的DNA分子，编码一些基本的线粒体蛋白和RNA。
2. ATP6和ATP8基因：这些基因编码线粒体内膜上的ATP合成酶亚基，该酶参与线粒体产生
能量的过程。
3. COX1、COX2、COX3基因：这些基因编码线粒体中的细胞色素c氧化酶亚基，参与细胞呼
吸链中的电子传递过程。
4. ND1、ND2、ND3、ND4、ND5和ND6基因：这些基因编码线粒体内的NADH脱氢酶亚基，参与细胞呼吸链中的电子传递过程。
5. CYTB基因：这个基因编码细胞色素b，在线粒体电子传递链中的质子泵功能中发挥作用。
6. 16S和12S rRNA基因：这些基因编码线粒体中的核糖体RNA，参与蛋白质的合成。
这些基因在斑马鱼的线粒体中发挥重要的功能，参与线粒体自身的维持和能量代谢过程。
斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应:补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达
斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应：补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【摘要】以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,使用原位杂交及实时荧光定量PCR方法,对斑马鱼补体基因(C3,C4,C9,Bf1,Bf2,Bf3)及其调节因子(RCA2.1,RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达模式及LPS刺激后表达量的变化进行了研究.结果表明,上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均为泛表达,从受精后24h至幼鱼阶段特异性表达于肝脏及消化道等器官.对胚胎显微注射LPS后,C3、C9、Bf1、Bf2、Bf3基因在早期胚胎中表达上调,RCA2.1基因表达下调,这与斑马鱼成鱼受到革兰氏阴性菌感染后补体分子(C3,C9,B因子等)的反应类似,表明其参与补体激活途径、溶膜途径及补体调节,提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统,参与急性期反应等免疫反应.【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2015(046)006【总页数】7页(P1444-1450)【关键词】补体;斑马鱼;胚胎;LPS;表达模式【作者】李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【作者单位】中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q786斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物的模式生物,与大多数鱼类相似,均为体外受精并发育。
在胚胎发育过程中,鱼卵暴露于水中,同水中大量的病原微生物直接接触。
这就引出一个问题,鱼类胚胎在发育过程中是如何保护自身免受外源微生物入侵的？鱼类的特异性免疫于脊椎动物中发育程度较低,免疫球蛋白种类和数量均有限,已有的研究表明,与鱼类特异性免疫相关的基因(Rag2,AID,TCRAC,IgLC-1,mIg,sIg,IgZ和DAB)直到胚胎受精后8天才对LPS诱导有强烈反应(Li et al,2011),说明在胚胎发育早期,特异性免疫尚未成熟,非特异性免疫尤其是补体系统在胚胎发育中的构建对其抵御外界病原体的入侵具有重要的意义。
斑马鱼检测方法
斑马鱼检测方法1. 前言斑马鱼，是一种常用的小型实验动物，广泛应用于生命科学研究中。
在对斑马鱼的进行实验研究时，为确保实验结果的有效性和可靠性，需要进行斑马鱼品系鉴定和病原体检测。
本文将简介斑马鱼检测方法，以及一些常用的斑马鱼病原体检测方法。
2. 斑马鱼品系检测方法斑马鱼品系检测是验证斑马鱼基因型纯性和稳定性的重要手段。
常用的斑马鱼品系检测方法有以下两种。
2.1 外部表型鉴定法斑马鱼的基因型表现到外部表型上，外部表型鉴定法是一种常见的斑马鱼品系鉴定方法。
外部表型鉴定法主要是借助斑马鱼在不同发育阶段的身体特征，如身体颜色、斑纹、尾鳍形态等，进行品系区分和鉴定。
2.2 分子遗传学鉴定法分子遗传学鉴定法是通过分析斑马鱼基因的遗传特征，对斑马鱼品系进行鉴定。
常用的分子遗传学鉴定方法有PCR（聚合酶链式反应）和RFLP（限制性片段长度多态性）。
3. 斑马鱼病原体检测方法斑马鱼作为常用的实验动物，在使用之前，需要进行病原体检测，以确保其健康状况和安全性。
常用的斑马鱼病原体检测方法有以下几种。
3.1 细菌检测法细菌感染是斑马鱼生存环境中的一种典型病原体，细菌检测法主要使用PCR技术、细胞培养、免疫蛋白检测等方法，对斑马鱼体内的病原细菌进行检测。
3.2 真菌检测法真菌感染也是斑马鱼生存环境中典型的一种病原体，真菌检测法通常使用真菌培养和显微镜检查的方法，来进行斑马鱼体内真菌的检测。
3.3 寄生虫检测法斑马鱼寄生虫感染主要针对虫卵、孢子等微小的物质，因此寄生虫检测法主要使用显微镜技术进行检测，如草履虫、水螅等。
3.4 病毒检测法病毒感染是斑马鱼生存环境中重要的一种病原体，病毒检测法包括电子显微镜、免疫蛋白检测、PCR等方法，对斑马鱼体内的病原病毒进行检测。
4. 总结斑马鱼作为常用的实验动物，其安全和健康对实验研究结果的确保至关重要，因此需要对斑马鱼进行品系检测和病原体检测。
常用的斑马鱼品系检测方法包括外部表型鉴定法和分子遗传学鉴定法，斑马鱼病原体检测方法包括细菌检测法、真菌检测法、寄生虫检测法和病毒检测法等。
斑马鱼多能性因子的研究进展
斑马鱼多能性因子的研究进展胡雨;姚纪花【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2012(34)9【摘要】The mammalian pluripotency factors, including transcription factors such as Pou5fl/Oct4, Sox2, Klf4 and Nanog, play critical roles in maintaining pluripotency of embryonic stem cells and inducing reprogramming of differentiated cells. However, the functions of vertebrate pluripotency factors in vivo have not been elucidated. Zebrafish(Z)amo rerio H.) is an excellent model for studying vertebrates' early embryo development. It allows functional studies of pluripotency factors to be conducted in an in vivo environment and therefore provides more accurate information on their roles. Nowadays, several homologs of mammalian pluripotency factors including oct4, nanog etc. have been identified in zebrafish. This review aimed at introducing the progress of the functional study on zebrafish pluripotency factors and comparing to those of other vertebrates.%哺乳动物多能性因子,主要包括Pou5fl/Oct4、Sox2、Klf4、Nanog等转录因子,不仅能够维持胚胎干细胞的未分化状态,同时也参与使分化细胞重编程回多能性状态的过程.目前对脊椎动物多能性因子在体(in vivo)功能研究报道极少.斑马鱼是研究脊椎动物早期发育分化的理想模型,它能够为多能性相关因子的功能研究提供在体环境,因而可以更准确地了解多能性因子的作用信息.近年来,已在斑马鱼中发现了多种哺乳动物多能性因子的同源基因,如oct4、nanog等.文章主要介绍了斑马鱼中多能性因子的相关研究进展,并与其它动物中的研究作一比较.【总页数】11页(P1097-1107)【作者】胡雨;姚纪花【作者单位】复旦大学生命科学学院,遗传工程国家重点实验室,上海,200433;复旦大学生命科学学院,遗传工程国家重点实验室,上海,200433【正文语种】中文【相关文献】1.应用小鼠早期胚胎活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化为多能干细胞的实验研究 [J], 刘婷;王立斌;朱永朝;金毅然;李玉奎;魏军2.超低温冷冻对小鼠桑椹胚多能性因子Oct-4表达的影响 [J], 周光斌;郭将;曾艳;程柯仁;傅祥伟;朱士恩3.应用小鼠早期胚胎活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化为多能干细胞的实验研究 [J], 刘婷;王立斌;朱永朝;金毅然;李玉奎;魏军4.斑马鱼模型与脑出血遗传分子机制研究进展 [J], 王雪琪;郭睿;陈雨麒;刘翼;游潮;王业启;田蕊5.以斑马鱼建立胰腺癌的人源肿瘤移植模型研究进展 [J], 孙基诚;孙巍;遇红梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
斑马鱼一个IFIT家族基因的鉴定及启动子分析
白都有介导 蛋 白． 白相互作 用的 Ｔ Ｒ 结构 域（ｅ ａ 蛋 Ｐ Ｔｔ ． ｒ
ｔ ｃｐｐｉ ｅｅｔ ｔｓ８ 且能被 ＩＮ、ｄＲ ｒ ｏ ｅ ｔ ｅＲ ｐ ａ Ｍｏｉ ）１ ｉ ｄ ｆ １， Ｆ ｓ ＮＡ和
第３卷 第 １ ６ 期
２ 年 １月 ０１ ２
水 生 生 物 学 报
ＡＣＴ Ａ ＨＹＤＲＯＢ ＯＬＯＧＩ Ｉ ＣＡ Ｉ Ｃ Ｓ ＮＩ Ａ
Ｖｏ１ ．３６，Ｎ Ｏ． １ Ｊ ａｎ． ， ２０ １２
Ｄ０Ｉ ０ ３ ２ ／ ＰＪ １ ３ ． ０１ ． ０ ０ ：ｌ ． ７ ４ Ｓ ． ０ ５ ２ ２ ０ ０ １
Ｉ Ｇ基 因特 有 的典型 ＩＲＥ结构 域 。 光素 酶活性 实验 揭示 Ｐ ｌ ： Ｓ Ｓ 荧 ｏｙＩ Ｃ和重组 ＩＮ蛋 白能 激活 斑马鱼 Ｉ Ｉ－ Ｆ ＦＴ Ａ启
动子 活性 。 外，过 量表 达 ＩＮ调 控 因子 此 Ｆ
和 Ｆ７ 能诱 导斑 马鱼 Ｉ Ｉ － 动子 活性 。 Ｆ ＴＡ启 实验 结果 证 明 ＩＩ － ＦＴ Ａ
１ 材 料 与 方 法
１１ 基 因克 隆及 生物 信息学 分析 ．
ｇｎ ｓＩＧｓ的表达 ［。 中许多 基 因如 Ｉ Ｇ１ 、 ｌ ｅ ｅ，Ｓ ） 其 Ｓ ５ Ｍｘ 、 Ｐ Ｒ均 能抑制 病毒 复制 【。在 这些基 因中， Ｆ ５ Ｋ ３ Ｊ ＩＩ ６和 Ｉ Ｉ４ 是 最 先发 现 属 于 同一个 家 族 的两 个 基 因 【 ， Ｆ５ ４ ，
斑 马鱼 一个 Ｉ Ｉ Ｆ Ｔ家族基 因的鉴 定及 启 动子分 析
刘 颖 张义兵 刘庭 凯 桂 建 芳
（ 国科 学 院 水 生 生 物 研究 所 ，淡 水 生 态 与 生 物 技 术 国 家 重点 实 验 室 ，武 汉 中 ４ ０ ７） ３ ０ ２
分析GFP-Lc3和GFP-Gabarap转基因斑马鱼胚胎中的自噬活动
分析GFP-Lc3和GFP-Gabarap转基因斑马鱼胚胎中的自噬活动摘要：自噬可介导大量胞内组分在溶酶体中的降解。
在动物胚胎发育过程中，卵黄蛋白的迅速降解和受精卵蛋白的合成导致胞内各结构的成型和细胞的分化。
斑马鱼是一种用来研究自噬的很独特的系统——部分是因为相对于其它生物，斑马鱼的胚胎发育迅速。
斑马鱼在技术上的优势使其特别适合于进行包括高通量药物筛查在内的各类研究。
为了研究斑马鱼体内的自噬，我们找到了2个斑马鱼Atg8基因的同源基因——lc3和gabarap，并培育出了表达连接有GFP标签的上述2种蛋白质的2个转基因斑马鱼品系。
与酵母的Atg8和哺乳动物的LC3蛋白类似，斑马鱼Lc3蛋白的翻译后修饰也是从胚胎发育的咽胚期开始的。
我们观察到在斑马鱼胚胎中有高水平的自噬活动，而且这种自噬活动可以被TOR抑制剂雷帕霉素或钙蛋白酶抑制calpeptin进一步上调。
另外，自噬也会诱导斑马鱼Gabarap在溶酶体中的累积。
因此，我们建立了一种便捷的斑马鱼工具来分析活体在胚胎发育过程中的自噬活动。
关键词：胚胎发育；溶酶体；溶酶体探针；蛋白质靶向作用；应激简介：自噬是胞内发生的一种降解过程，它可以将胞质内的成分转运到溶酶体中。
自噬有多种形式，包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。
研究的最充分的是巨自噬，本文中将以“自噬”指代“巨自噬”。
在自噬过程中，围绕着要降解的胞内容物可形成双膜结构的囊泡——被称为自噬体。
自噬体随后与溶酶体融合，融合后自噬体内膜降解，其内容物随后被水解酶降解，降解后的大分子物质被释放回胞质中以作为细胞的养料。
对自噬的研究是很重要的，因为自噬在人体的健康和病理过程（如主动免疫防御、抗原呈递、肿瘤抑制、心血管疾病、胃肠道疾病、神经系统退行性疾病和人体的寿命）中均发挥作用。
对酿酒酵母进行高通量的突变筛查发现了大约31个与自噬有关的基因（ATG 基因），这些基因中的多个在哺乳动物中都有其对应的同源基因。
斑马鱼毛细胞损伤及再生研究进展
斑马鱼毛细胞损伤及再生研究进展翁宇航;龙孝斌【期刊名称】《中华耳科学杂志》【年(卷),期】2015(000)001【摘要】内耳毛细胞的损伤是引起感音神经性聋的常见原因，而寻找刺激毛细胞再生的可能条件，是治疗感音神经性聋的重要方向；斑马鱼作为新兴模式生物，其胚胎及早期幼鱼通体透明，侧线毛细胞位于体表，以及生殖周期短、繁殖能力强且基因与人类基因约87%相似。
鉴于斑马鱼以上生物学特性，耳科学研究者亦采用斑马鱼模型探讨毛细胞损伤及再生机制。
本文拟对斑马鱼毛细胞损伤及再生的相关研究进展进行综述。
%Damage of sensory hair cells in the inner ear is one of the most common pathogeny to cause sensorineural deafness, while searching for therapies for regenerating damaged hair cells has been an important research aspect. With their embryos and larvae being hyaline and their hair cells located in the lateral line exposing to the environment, as well as their short breeding cycles, strong reproduction capacity, and a 87%homology to human genome, zebrafish can be used as a model system for hair-cell study. In the last few decades, there have been many studies focusing on the mechanism of injury and re⁃generation of zebrafish hair cells. Here, we review recent discoveries in this field.【总页数】4页(P83-86)【作者】翁宇航;龙孝斌【作者单位】南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉头颈外科广州 510282;南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉头颈外科广州 510282【正文语种】中文【中图分类】R764.3【相关文献】1.顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞损伤及再生模型的建立 [J], 芈肖肖;严健;李圆;施军平2.哺乳动物内耳毛细胞损伤再生性修复的研究进展 [J], 娄向新;袁崇刚3.斑马鱼视觉损伤和视神经再生的研究进展 [J], 陈维昕;金铭;张旭4.Wnt/β-catenin信号通路对斑马鱼侧线毛细胞再生影响的实验研究 [J], 芈肖肖;严健;李圆;施军平5.地塞米松对顺铂致斑马鱼毛细胞损伤的保护作用研究 [J], 涂钰莹;易英;涂玉梅;龙孝斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成年斑马鱼脊髓损伤修复中脑gdnf 和nos 基因的表达
成年斑马鱼脊髓损伤修复中脑gdnf 和nos 基因的表达谢琳;房萍;林金飞;潘洪超;张帆;申延琴【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2013(035)004【摘要】成年斑马鱼(Danio rerio)具有很强的脊髓损伤后自主修复的能力,但目前其机制不明.为了研究斑马鱼中脑组织对脊髓再生的影响,文章应用成年斑马鱼脊髓损伤模型,采用实时定量PCR 方法和原位杂交技术,检测了斑马鱼脑中胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)和一氧化氮合酶(nos)基因在脊髓损伤后4 h、12 h、6 d、11 d的表达情况,展示了这两种基因在斑马鱼脑内不同核团的动态表达变化.结果显示,成年斑马鱼脊髓损伤后,神经营养因子gdnf 基因在损伤急性期(4 h、12 h)和神经修复期(6 d、11 d)于斑马鱼脑内呈现显著性升高(P<0.05),而一氧化氮合酶基因nos 的表达于损伤急性期显著性升高 (P<0.05),随后下降,并在修复期 (11 d)显著降低(P<0.05).这表明,脊髓损伤后,高表达gdnf 基因同时低表达nos 基因的脑环境给脊髓损伤提供了良好的神经再生微环境,从而可能促进轴突的再生长及运动能力的恢复.%Recently, it is unclear about the mechanism of notable regenerated ability of adult zebrafish after spinal cord injury. To investigate the effects of brain on restoration from spinal cord injury, adult zebrafish spinal cord injury model was built and brain samples were dissected at different time points after the injury. Real-time quantitative PCR and in situ hybridization were applied to reveal the dynamics of glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) and nitric oxide synthases (nos) mRNA expression in various regions of zebrafish brain. The results showed that, compared to shamgroup at each time points separately, the expression of gdnf mRNA in adult zebrafish brain during both acute phase (4 h and 12 h) and chronic phase of neuroregeneration (6 d and 11d) increased significantly (P<0.05). The expression of nos mRNA in zebrafish brain enhanced during acute phase, and then reduced to the level lower than the sham group during the chronic phase of neuroregeneration (11 d) (P<0.05). This suggests that brain may promote neural axons regeneration in spinal cord via a more beneficial microenvironment which retains higher level of gdnf and lower level of nos.【总页数】7页(P495-501)【作者】谢琳;房萍;林金飞;潘洪超;张帆;申延琴【作者单位】汕头大学医学院神经科学中心,汕头515041【正文语种】中文【相关文献】1.成年斑马鱼脊髓损伤修复中BDNF/TrkB的表达研究 [J], 赵厚德;崔春;刘春杰;胡程铭;申延琴2.成年斑马鱼脊髓修复中脑内vegf基因的表达变化 [J], 张烨;谢琳;房萍;林金飞;张治华;申延琴3.神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后GDNF基因表达的影响及意义 [J], 王岩峰;吕刚;黄涛;金哲;于德水;马旭4.GDNF在成年猴脊髓表达的免疫组织化学研究 [J], 王昭君;刘佳;尹昭;王廷华5.静脉移植骨髓间充质干细胞促进脊髓损伤后GDNF基因的表达 [J], 李国良;陈俊;杨松巍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鱼类性别相关基因FTZ-F1的研究进展
鱼类性别相关基因FTZ-F1的研究进展
曹谨玲;陈剑杰;甘西;罗永巨
【期刊名称】《水产学杂志》
【年(卷),期】2010(23)4
【摘要】FTZ-F1基因属于孤核受体超家族成员,最初是在果蝇(Drosophila)中发现的,该基因在果蝇胚胎发生的早期调控体节分化基因ftshi-tarazu(FTZ)表达.目前已经发现了很多它的同源基因.研究证明它在类固醇生成、性别分化过程中都发挥着重要的作用.鱼类在脊椎动物系统进化中处于承前启后的地位,是脊椎动物中分布最广、种类最多的类群,具有多种多样的生物学特征和重大的经济价值,所以对于鱼类性别决定机理的研究具有重大意义.文章就鱼类中发现的性别相关基因FTZ-F1,及该基因在胚胎发育过程中的作用、在性逆转鱼中的作用及与芳香化酶的相互作用关系等进行了综述,旨在为系统研究鱼类性别决定机制提供参考.
【总页数】6页(P54-59)
【作者】曹谨玲;陈剑杰;甘西;罗永巨
【作者单位】山西农业大学动物科技学院,山西,太谷,030801;山西农业大学动物科技学院,山西,太谷,030801;广西水产研究所,广西,南宁,530021;广西水产研究所,广西,南宁,530021
【正文语种】中文
【中图分类】S917
【相关文献】
1.鱼类性别决定及分化相关基因研究进展 [J], 路畅;苏利娜;朱邦科
2.鱼类性别决定与分化相关基因研究进展 [J], 文爱韵;尤锋;徐永立;张培军
3.鱼类性别相关基因及性别特异标记的研究进展 [J], 李静;陈松林;温海深
4.鱼类性别决定机制及相关基因研究进展 [J], 李云航;孙鹏
5.硬骨鱼类性别决定与分化相关基因研究进展 [J], 李永婧;吴利敏;李学军
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ｈｕｍａｎ
２
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ，２００４．１３（１８）：
１４３—２ １５３． Ｅ Ｒ１，Ｋｅｌｌｙ Ｊ Ｊ，Ｓｕｄ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｃａｐｒｉｎ一１ ｉｓ
Ｎｏｖ．
２０１４
Ｖ０１．３３
Ｎｏ．４
光周期为１４ ｈ光照／１０ ｈ黑暗，饵料为丰年虾，每日 中午饲喂１次。当天开灯后立即将收卵皿置于鱼缸 中，每２０～３０ ｍｉｎ收集鱼卵１次。
２．２
Ｇｆｉ表达强度进行相关性分析并进行结果统计。
３结果与分析
三型鱼中可以看到ＰＯＵ４ｆ３的神经丘及其侧线 组织，在野生型的鱼发育最强，而在缺失该基因的纯 合转基因鱼发育最弱，而杂交鱼介于二者之间。神经 丘位于脑部，包含有听觉及视觉的毛细胞，而侧线位 于身体纵轴与脊椎相平行，二者是斑马鱼的神经组 织。ＰＯＵ４ｆ３叫一、ＰＯＵ４ｆ３叫一和ＰＯＵ４ｆ３州＋分别见
ｔｉｓｓｕｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ １（Ｇｉｌｌ）ａｓ
ｌｉｋｅｌｙ
ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｕ４ｆ３．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｚｅｂｒａｆｉｓｈ；Ｇｆｉ；ＰＯＵ４ｆ３；ｎｅｒｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ｒｅｌｅｖａｎｃｅ
近年来，通过单核苷酸多态性、高通量基因测序、 基因芯片、基因组学等手段干预治疗癌症、遗传性疾 病、神经再生，使临床的诊治能够快速准确的应用此 技术。基因有些片段是无功能的，而蛋白质是生命活 动的基础，我们通过建立疾病的蛋白质组学发现基因 的相互作用，采用斑马鱼表达２个关联耳聋基因，观 察其中的相互关联作用。 １
Ｕ４ｆ３叫的鱼ｏ ４］
取野生型鱼和构
建的ＰＯＵ４ｆ３…一的鱼二者的雌雄比例均为５０％，按 前述的斑马鱼饲养方式饲养，收集受精卵发育成鱼。 饲养方法同前。将斑马鱼分为３组，分别为 ＰＯＵ４ｆ３。～、ＰＯＵ４ｆ３叫一和ＰＯＵ４ｆ３。“，提取这３组 鱼神经组织中的Ｇｆｉ（ｇｒｏｗｔｈ
［３］简清，白俊杰，叶星，等．斑马鱼Ｍｙｌｚ２启动子的克隆与转 绿色荧光的转基因鱼的构建［Ｊ］．中国水产科学，２００４，１１
（５）：３９１—３９４．
ｒ４］齐麟，冯晓，向志明，等．斑马鱼血清样淀粉Ａ基因在病毒 感染中的表达分析口］．河南大学学报：自然科学版，２０１３，
４３（５）：５４０—５４４．
［５］Ｈｅｒｔｚａｎｏ Ｒ，Ｍｏｎｔｃｏｕｑｕｉｏｌ Ｍ，Ｒａｓｈｉ—Ｅｌｋｅｌｅｓ Ｓ，ｅｔ ａ１．
浚 ，一－避
Ｚ
ａ：野生型斑马鱼表达Ｇｆｉ； ｂ：杂合型斑马鱼表达Ｇｆｉ； Ｃ：ＰｏＵ４ｆ３敲除纯合型的鱼表达Ｇｆｉ。 图４ 表１ Ｇｆｉ的ＲＴ—ＰＣＲ的表达图
及镫骨固定［ｓ－７３，还可以导致噪声性耳聋［８］。我们的 实验的结论提示，Ｇｆｉ与ＰＯＵ４ｆ３的表达有相关性。 我们是否可以通过干预Ｇｆｉ对ＰＯＵ４ｆ３的表达调节， 是对未来基因治疗的一个设想。 参考文献：
［１］朱新平，夏仕玲，张跃，等．转抗冻蛋白基因鲮鱼的初步研
究ｆＪ］．中国水产科学，１９９７，４（２）：７９—８０．
荧光显影ＰＯＵ４ｆ３＋卜、ＰＯＵ４ｆ３＋７一和ＰＯＵ４ｆ３—７一（条）
ＰＯＵ４ｆ３”７ ＰＯＵ４ｆ３“７
ＰＯＵ４ｆ３一合计
注：Ｘ ２＝１６．５７９，Ｐ一０．０１；）（２＝９．２，Ｐ＜０．０１。三组之 问有显著性差异。
ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｉｎ Ｅａｓｙ
图ｌ
Ｐ（）Ｕ
４ｆ：｛７侧线与神经丘组织
纯化后连入ｐＧＥＭ—Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒ，在ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７全自动荧光测序仪上进行序列测定。 ＤＮＡ分析软件Ｖｅｃｔｏｒ
２．２．２
ＮＴＩ Ｓｕｉｔ
６．０分析测定结果。 用培育线性化
构建ＰＯＵ４ｆ３叫一的鱼
河南大学学报（医学版）２０１４年１１月
第３３卷第４期
斑马鱼耳聋基因Ｇｆｉ与ＰＯＵ４ｆ３的关联性
冯
晓１’２，齐
麟３，孟
娟２
（１．河南大学淮河临床学院，河南开封４７５００１；２．郑州大学第一附属医院耳科，河南郑州４５００５２；３．铁道警察学院
治安系，河南郑州４５００５２）
摘
要：目的
运用转基因斑马鱼探讨信号蛋白Ｇｆｉ与ＰＯＵ４ｆ３之间关系。方法
ａｎ
Ｄｅｔｅｒ ｔｈｅ
Ｐｏｕ４ｆ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｉｌｄ ｕｐ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｏｕ４ｆ３，ｗｈｉｃｈ
ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
ｃａｎ
ｏｂｖｉｏｕｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｆｉ ａｎｄ
ａ
ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ
ｎｅｖｅｒ
中图分类号：Ｑ７８６
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２—７６０６（２０１４）０４—０２６７—０３
Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｆｉ ａｎｄ Ｐｏｕ４ｆ３ ｂｙ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ
ＦＥＮＧ Ｘｉａ０１一，ＱＩ Ｌｉｎ３。ＭＥＭＧ Ｊｕａｎ２
（１．Ｈｕａｉｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｅｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ，Ｈｅｎａｎ ４７５００１，Ｃｈｉｎａｉ ２．ａｆｆｉｃｉａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌＺｈｅｎｇ—
材料
ＤＮＡ模板提取试剂盒（日本Ｔａｋａｒａ公司）；其他
２
方法
２．１斑马鱼的养殖 野生型斑马鱼成鱼购自青岛国际斑马鱼资源中 心，养殖于（２８．５±１）℃的人工海水（反渗水配制， 高级海水晶，天津中盐海洋生物科学有限公司）中，
试剂均为国产分析纯；引物的合成由上海英骏生物技 术有限公司完成；ＲＴ—ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ
动荧光测序仪（美国ＰＥ ＡＢＩ公司）；构建ＰＯＵ４ｆ３基 因缺陷的鱼，以正常野生型的鱼作为对照，构建缺陷 鱼采用受精卵细胞胞内注射停止转系序列的ＤＮＡ 片段构建ＰＯＵ４ｆ３叫一的纯合体，正常野生型经基因 型分析确定为ＰＯＵ４ｆ３十／＋，野生型鱼与纯合型鱼共 同饲养，自然繁殖的受精鱼卵发育成鱼作为
ＰＯＵ４ｆ３＋／－。
ＧＡＡＣＧＧＣＡＡ ＧＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＣ；下
游：ＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＣＴＡＡ。以 斑马鱼基因组ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，反应条 件如下：９４℃预变性３ ｒａｉｎ＋每循环包括９４℃变性
１
ｍｉｎ，５５℃复性１ ｍｉｎ，７２℃延伸４ ｍｉｎ，共３０个循
环，最后１个循环结束后再７２℃延伸７ ｍｉｎ。扩增 片段经Ｗｉｚａｒｄ
图１、图２、图３。
ＰＯＵ４ｆ３缺陷的转基因斑马鱼模型构建 取２０ ｎｇ新
２．２．１提取ＰＯＵ４ｆ３的停止转录序列
鲜斑马鱼侧线及神经丘组织，按停止转录序列使用手 册提供的方法提取基因组ＤＮＡ；采用Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系 统，使用启动子与表达基因之间停止转录序列的方法 使ＰＯＵ４ｆ３不表达。根据Ｐｕｂｍｅｄ Ｇｅｎｅｂａｎｋ的斑马 鱼ＰＯＵ４ｆ３启动子基因序列的反向封闭使其不表达， 设计１对特异引物，上游：ＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴ—
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ
ａｓ
ａ
ｉｎｎｅｒ
ｅａｒｓ
ｆｒｏｍ Ｐｏｕ４ｆ３ｄｄｌ／ｄｄｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｇｆｉｌ
ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｕ４ｆ３ ｄｅａｆｎｅｓｓ
ｇｅｎｅＥＪ］．
４讨论
Ｐ０ｕ４ｆ３是ＩＶ ＰＯＵ转录因子，它的主要功能是 毛细胞发育，Ｇｆｉ是一个独立生长因子．表达ＤＮＡ双 螺旋结构蛋白的阻抑蛋白，是调节基因的产物，与操 纵基因的结合可以阻止受调节基因的表达。当阻抑 蛋白与操纵基因结合时，就会阻止ＲＮＡ聚合酶启动 转录，基因的表达就被关闭。在无阻抑蛋白时．ＲＮＡ 聚合酶可以识别受调节基因的启动子，使这种基因得 到表达。这一蛋白与听泡的囊性结构发育有关。近 年来发现斑马鱼与人类基因有高达８７％的相似性， 而斑马鱼表面的侧线与神经丘是一种类似于人体听 觉器官的结构。ＰＯＵ４ｆ３是ＩＶ ＰＯＵ转录因子，它的 主要功能是毛细胞发育，这在人类和小鼠的实验中已 得到验证。ＰＯＵ４Ｆ３的突变是人类常染色体显性遗 传进展性非综合征性耳聋的基础，而Ｇｆｉ是一个独立 生长因子，在体外实验中可以证实ＰＯＵ４ｆ３对于Ｇｆｉ
鱼全长为４
２１７
ｂｐ，实验中扩增长度为６４３ ｂｐ。对
ＰＯＵ４ｆ３一”、ＰＯＵ４ｆ３叫一和ＰＯＵ４ｆ３叫一中斑马鱼的
万方数据
河南大学学报（医学版）
２０１４年１１月
第３３卷第４期
２６９
有调节作用，ＰＯＵ４ｆ３导致耳聋主要是由于其突变影
：一参然耘ｉ
；
影州７
ｔ＂。
杉？
ｌ
响Ｇｆｉ表达。Ｇｆｉ对于胎鼠的毛细胞表达有很重要的 影响，有研究［５１表明在杂合子的胎鼠毛细胞可以发 育，但是在发育２天后会过早的发生凋亡。近年来的 研究表明，毛细胞能通过增殖或非增殖的机制支持细 胞再生，ＰＯＵ４Ｆ３在此过程中很可能对新生毛细胞 的迁移发挥重要作用；在毛细胞受到非致死性损伤 后，ＰＯＵ４Ｆ３还参与修复静纤毛。人类也有相应的 致聋基因ＰＯＵ４Ｆ３，位于ＤＦＮＡｌ５，即染色体５ｑ３１的 位置，缺陷时导致非综合征性聋，出现感觉神经性聋
ｚｈｏｕ。Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ ４５００５２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅｎａｎ ４５００５２，Ｃ壳ｉｎａ）
ｓｅｃｕｒｉｔｙ
ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｒａｉｌｗａｙ Ｐｏｌｉｃｅｍｅｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｕｓｉｎｇ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｆｉ ａｎｄ Ｐｏｕ４ｆ３ ｂｙ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｒｅ ｉｓ
［２］陈浩，杨健，王跃祥，等．ｖｔｇｌ启动子调控绿色荧光蛋白表