基因诊断(5)

合集下载

相关主题

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

Real-Time (ASR)
Devlepoed
HCV Assay
定性、定量检测
定量检测，检测限为10-50 IU/ml~10-30百万IU/ml
目录目录
三、人类乳头瘤病毒（HPV）
（一）病毒基因组结构
E7 E1a E6 NCR HPV16
7904.1
E1b
E4 E2
E5
L2
L1
E1-E7（早期基因）：控制病毒的复制和转化功能 L1 L2（晚期基因）：编码病毒的衣壳蛋白 NCR（非编码区）
基因诊断
Gene Diagnosis
目录
内容提要

第一节第二节第三节第四节
基因诊断学基础感染性疾病的基因诊断遗传病的基因诊断复杂性疾病的基因诊断（肿瘤）
目录
第一节
基因诊断学基础
Basis of Gene Diagnostics
目录
基因诊断之父—简悦威
1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用
核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫
血进行诊断。
目录
一、基因诊断的概念、特点及临床意义
定义：
利用分子生物学技术，
检测基因及基因表达产物的存在状态，
基
因
对人体疾病作出诊断的方法。
基因诊断检测的目标分子 DNA RNA 蛋白质或者多肽。
疾
病
目录目录
诊断依据(遗传物质改变)
疾病感染性疾病遗传性疾病复杂性疾病
目录目录
基因诊断中常用的分子生物学方法比较
方法 PCR SSCP RFLP DNA测序生物芯片
优点与问题灵敏度、特异性高操作简便、检出率不高结果可靠但限制较多可自动化，但不适宜广泛使用效率高，成本高，不适宜广泛使用
解决方案选择合适的探针设计合适的引物选择合适的片段选择合适的限制酶与PCR配合使用选择合适的芯片
（1）RT-PCR
这是目前国内外采用较多的一种检测方法，该能对HIV-1的A到H亚型病毒进行准确地定量测定。
目录目录
表 PCR检测HIV中部分常用的引物和探针
靶序列引物和探针序列扩增片段长度（bp）
LTR
引物 5’-ACTAGGGAACCCACTGCT-3’ 5’-GGTCTGAGGGATCTCTA-3’ 探针 5’- ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT -3’ 引物 5’- ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT -3’ 5’- TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC -3’ 探针 5’- ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC -3’ 引物 5’- TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCAC -3’ 5’- CCTACTATACAAATCATCCATGTATTC -3’ 探针 5’- ATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCT -3’
核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐
目录目录
第二节
一、总论
感染性疾病的基因诊断
二、病毒的基因检测三、病原菌的基因检测
目录目录
一、感染病基因诊断的总论
（一）、感染性疾病分子诊断的策略

1.一般性检出策略 2.完全检出策略

目录目录
1. 一般性检出策略和方法
感染性疾病分子诊断一般性检出策略：针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物的 DNA/RNA，它能够判断有无感染和是何种病原体感染。
DNA、RNA或蛋白质水平变化，病毒基因及其转录产物在体内从无到有基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活癌基因表达水平从低到高；
外伤
目录
基因诊断的特点
高特异性高灵敏性早期诊断性
应用广泛性
目录
二、基因诊断中常用的分子生物学技术

检测方法
RT-PCR TMA RT-PCR bDNA RT-PCR RT-PCR RT-PCR
评价
定量检测，检测下限 50 IU/ml 定量检测，检测下限5 IU/ml 定性检测定量检测，检测限为 615~7.7百万IU/ml 定量检测，检测限为600~8 十万IU/ml
Laboratory Test
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing）生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting）免疫组织化学诊断
调控基因：
基因组示意图
目录目录
基本情况

2类型（1，2）
三群：主群，局外群，新群 10亚型：M群中，A-J，以ENV基因分型
目录目录
（二）分子诊断方法

蛋白水平检测初筛：ELISA，免疫荧光试验确证：Western Blot p24, gp120
目录目录

核酸水平检测
1、病毒量检测
目录目录
表临床应用的HCV RNA检测试剂盒
检测试剂盒
Amplicor HCV Test v2.0 Versant HCV RNA Assay In-Laboratory Devlepoed Versant HCV RNA v3.0 Assay Amplicor HCV Monitor Test v2.0
1976年诺贝尔奖
目录目录 Baruch Samueቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Blumberg
1.病毒基因组结构

S 表面蛋白
P 聚合酶

C 核心蛋白
X 转录蛋白
目录目录
2.分子诊断方法
（ 1 ）信号放大技术
支链DNA技术（ bDNA）
2×105拷贝/ml，不太适用于低浓度检测。

Simens

range
(2,000 to 109 copies/mL)
HPV18型
HPV6型 HPV11型 HPV33型
5’-GACACCTTAATGAAAAACGACGA-3’ 5’-CGTCGTTGGAGTCGTTCCTG-3’
5’-TAGTGGGCCTATGGCTCGTC-3’ 5’-TCCATTAGCCTCCACGGGTG-3’ 5’-GGAATACATGCGCCATGTGC-3’ 5’-CGAGCACGACGTCCGTCCTCG-3’ 5’-ATGATAGATGATGTAACGCC-3’ 5’-GCACACTCCATGCGTATCAG-3’
目录目录

HBV定量
HBV病毒定量
目录目录
3．耐药性检测（1）P基因，YMDD
ATT ATG GTG

YVDD、YIDD）。
（2）HBV-DNA前C区基因突变。
PCR-RFLP DHPLC 荧光定量（三探针）

测序
目录目录
荧光定量（Tm曲线）
（三）临床意义
1、HBV感染的早期诊断 2、监测治疗效果
LTR：长端重复序列（包含启动子、增强子及TATA序列等）
结构基因：
gag基因：编码P55蛋白前体 pol基因：编码逆转录酶、蛋白水解酶及整合酶 env基因：编码包膜前体蛋白 rev基因：编码一种转录后反式激活因子 tat基因：编码一种反式激活转录因子 nef基因：编码负调节蛋白 vif基因：编码病毒感染因子 vpu基因：编码产物与病毒的装配、成熟和释放有关 vpr基因：编码一种弱转录激活因子
目录目录
(四)感染病疾病分子诊断的结果解释
1．阴性结果增效率。注意检测灵敏度、核酸提取及扩
2．阳性结果需考虑检测方法本身的特异性和可能受到的污染。 3．定性检测结果定性分子检测结果并不能提供有关病原体活力的相关信息。 4．疾病状况的判断核酸存在不一定代表患病
目录目录
(五)感染疾病分子诊断的临床应用及评价
105
gag
115
pol
308

注意，ENV基因不用作靶基因*
目录目录

（2）液相杂交检测
125I标记核酸探针，与变性DNA杂交。
γ闪烁计数仪定量检测标记的探针。灵敏度为106拷贝/ml。
目录目录
（3）杂交捕获系统
信号放大3000倍。灵敏度为4700拷贝/ml。
Release Nucleic Acids
Hybridise RNA Probe
capture
目录目录
2. 完整检出策略和方法
感染性疾病分子诊断完整检出策略：通过分子杂交结合PCR技术、特殊PCR技术和芯片技术、核酸测序技术的运用，对大多数感染性病原体作出明确判断，而且能够诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分
类、分型（亚型）和耐药性鉴定。
目录目录
二、感染病疾病分子诊断的常用方法
103
280 360 455
目录目录
四、人类免疫缺陷病毒
目录目录
目录目录

HIV发现者 2008诺贝尔奖医学或生理学
目录目录
LTR
gag pol
vif vpr
env tat rev nef
LTR
HIV-2
LTR gag pol vif
vpu env vpr vpx tat rev nef LTR
HPV16基因组结构模式图
目录目录
（二）HPV的分子检测方法
1、杂交捕获检测法(FDA批准)
该检测方法只能作出危险度判断，并不能确定HPV的具体型别。
对于高危险性HPV的检测会出现假阳性的结果，可能是由于高危险性HPV探针同低危险性 HPV的非特异性结合，这种情况多出现在检测高浓度的HPV6或者HPV42 DNA样本时。
缺点：与其它结果不相符

应用原则：注意将分子检测结果结合临床特别是患者病史及、综合考虑体检、X片 CT及其它各种检测结果，以便准确判断病情。
目录目录
二、病毒的基因检测

（一）HBV （二）HCV （三）HPV （四）HIV （五）HSV （六）CMV
目录目录
（一）乙型肝炎病毒
目录目录
2．靶分子扩增技术检测方法
（1）以PCR为基础的扩增方法
（2）替代的扩增方法（3）探针扩增系统优点：简便、快速、灵敏度高
缺点：易由于背景污染、扩增产物污染导致假阳性结果
目录目录
(三)感染疾病分子诊断的标本处理
1．标本的选择主要取决于相关疾病的临床表现、感染的病理学机制。
2．标本量及抗凝剂标本量要求少，但不同方法所需标本量可能不同。肝素不适于分子检测标本的抗凝。 3．标本的传送、保存比较灵活，传送过程避免污染，一般保存于-80℃。 4．标本的预处理包括核酸的提取，另外还包括扩增抑制物的去除及潜在危险病原体的灭活。
3、判断病情，指导制订合理的治疗方案
目录目录
二、丙型肝炎病毒
目录目录
HCV的分子检测方法
HCV 的RNA定性和定量分析方法： RT-PCR，
TMA，
bDNA，
逆向杂交多列探针检测法reverse
直接测序
hybridization
based line probe assay，INNO-LIPA
目录目录
2、核酸扩增法
FQ-PCR、
竞争性PCR
杂交PCR。
芯片
目录目录
表
扩增位置通用引物 HPV16型
人乳头状病毒基因检测常用的引物
引物序列 5’-CGTCCAAGAGGAAACTGATC-3’ 5’-GCACAGGGACATAATAATGG-3’ 5’-TTTTGGGTTACACATTTACAAG-3’ 5’-TGTCTGCTTTTATACTAACCG-3’ 扩增片段大小(bp) 450 119
1.
信号放大技术检测方法
采用多酶、多探针或二者结合等方式来增加探针标记物的浓度使检测信号得到放大，从而提高检测的灵敏度。

优点：稳定性、重复性及特异性都较高，结果准确，不存在可能污染的问题。缺点：灵敏度较低，不适用于微量病原微生物的分子检测。
目录目录

常见的几种方法

液相杂交法杂交捕获法支链DNA技术
dioxetane
AP
Detect, read Label for Detection
FDA批准
目录目录
（4）PCR法
1）定性

S、C、P和X基因中的高度保守序列
2）定量

实时定量PCR技术（最灵敏的方法）

TaqMan探针 TaqMan-MGB探针
能够检测少至10拷贝/mL的HBV DNA
1、应用

弥补血清学检测技术的缺陷检测不能培养或生长缓慢的病原微生物通过病原微生物的定量检测监测疾病微生物耐药性的检测细菌分型及流行病学调查
目录目录
2、评价
优点：（1）简便、快速且灵敏度和特异性都较高（2）适用于一些疾病的早期诊断、确诊性诊断及爆发性感染的大规模检测。