附植前胚胎发育的影响
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张利生! 毕春明! 李劲松! 吴昱琪! 寇朝辉! 姜 岩! " 吕自力" 王小宁" 孙青原! 陈大元!"
! # 中国科学院动物学研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室，北京 !$$$%$； " # 新疆金牛生物股份有限公司，生物科学研究院，乌鲁木齐 %&$$"’
蒋满喜!
摘要
实验比较了克隆牛过程中电融合条件的改善对附植前胚胎发育的影响 # 电融合强度为
胰酶消化贴壁细胞，并将消化下来的细胞反复吹打 成单个细胞的悬液，保存于 6=H= ) ;3# （ GI7!1） 中 待用 $ ［ 2］ ：将 ! #" # & 核 的 移 植 核 移 植 的 方 法 见 文 献 （ !7） ="期卵母细胞置于含4 $ ?! : ) ’*细胞松弛素 7
!#$# !
!?47* ) % 鼠胎儿成纤维细胞消化下来，吹散成细胞 悬液，在平皿中做成 3,,! * 的液滴，覆盖石蜡油，
［%］ 液 （6J山梨醇 ,$#? ’(" ) *，醋酸钙 ,$3 ’’(" ) *，醋酸 镁, $ ? ’’(" ) *， /KLK5 , $ ? ’’(" ) *， 78M 3 ’: ) ’*） 或 ［#］ 甘露 醇 融 合 液 （ 甘 露 醇 , $ #4 ’(" ) *， /KLK5 , $ ? 中平 ’’(" ) *，!.!"# , $ ,? ’’(" ) *，=:812 , $ 3 ’’(" ) *）
［!， "］ 重复性好而备受核移植工作者的青睐 ，但是电 ［&］ 融合可使一部分重构胚发生碎片化和死亡 # 世界
发育的影响，优化了融合操作程序，再次顺利生产 出了体细胞克隆牛 #
!
材料与方法
除非另外说明，所有试剂均购自 ?.@,- 公司 # 电
融合仪为澳大利亚 AB58C8@.0 产品 （型号： :DCEFGH +I(!） # !"! 卵母细胞体外成熟
! # & # ! 用于核移植的体细胞的培养 所用供核细胞 来源于新疆金牛生物 股 份 有 限 公 司 的 高 产 荷 斯 坦 （/("5E.D） 奶牛 $ 耳朵皮肤组织用无菌生理盐水洗 9 次 后充分剪碎，用 ,$ #?< 胰蛋白酶 2@ 冷消化 3# A 后， ［2］ 描述方法经原代、传 94@ 热消化 9, ’CD，根据文献 代培养后，得到耳皮肤成纤维细胞，用于核移植 $ !#&#& 取出妊娠 32 F 的雌性 !?47* ) % 小鼠胎儿，用剪刀和镊子钝性分离胎鼠皮 共培养细胞的准备
克隆牛 核移植 电融合
自“多莉”羊诞生后，体细胞核移植技术成为 了当前生命科学研究领域的一个热门话题 # 但是目 前克隆技术的效率仍然很低 # 融合是由体细胞核移 植生产克隆动物的一个关键步骤，对融合条件进行 优化会提高成功生产克隆牛的效率，同时我们也对 在体外成熟的卵母细胞因电刺激所发生的物理化学 反应有进一步的了解 # 由于电融合对细胞的毒性小，
上第一批克隆牛的制作过程中，体细胞的融合率接 近 ’$> ，但是电刺激后保持形态完好从而能够进入 培养液进行培养的只占到融合总数的 %$> 左右，相 当一部分重构卵都在电融合后死掉或者发生形态异
［!］ 常 ，这和它的融合条件不无关系，所以有必要对
! # ! # ! 获取卵巢 从屠宰场收集性成熟的新疆“土 牛” （当地的一种乳肉兼用型牛） 的卵巢，放入含 !> 青、链霉素的 &JK 生理盐水中，在 ) 1 内运至实验 室 # 用同样生理盐水清洗 & L ) 次 # ! # ! # # 卵丘卵母细胞复合体的抽取 用 !% 号注射针 抽取直径为 " L !$ ,, 大的卵泡中的卵泡液，以获取 卵丘卵母细胞复合体 （ADA<） # 收集包裹 & 层以上卵丘 细胞的卵母细胞，放入 MIN? （含有 !&’# *% ,,8/ ; C H-(
!)$ : ; ,,， !$! < ; 次时的效率要较 !$$ : ; ,,，"$! < ; 次和 !%$ : ; ,,，!$! < ; 次时高，可以降低融合后 重构胚死亡率，提高克隆牛囊胚发育率 # 施加直流电脉冲前先给予 = : 交流电场预处理数秒钟，然 后在电极之间通以两个直流脉冲 （!)$ : ; ,,，!$! 与不用交流电预处理对融合率和 < ; 次，间隔 $ # ! <） 重构胚的发育率无显著差异 # 另外实验比较了甘露醇和山梨醇两种融合液对融合及重构胚发育的 影响，结果表明囊胚发育率差异不显著，但山梨醇较甘露醇融合液更容易操作 # 实验生出的 ) 头克 隆牛存活至今 # 关键词
衡 3 B # ’CD，移入电融合槽中，拨动卵，使体细胞 平行 $ 与卵母细胞的接触面与两电极 （间距 3 ’’） 融合的操作分为以下 2 种方案： （ 3&, N ) ’’， M：在电极之间通以两个直流脉冲 ； 3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） （ 3,, N ) ’’， 7：在电极之间通以两个直流脉冲 ； #,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） （ 32, N ) ’’， !：在电极之间通以两个直流脉冲 ； 3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） 6：施加直流电脉冲前先给予 ? N 交流电场预处 理数秒钟，然后在电极之间通以两个直流脉冲 （32, N ) ’’，3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） $ 融合操作后的卵子移入 =3>> 中洗 9 遍，置于 覆盖 石 蜡 油 的 =3>> 中， 于 !1# 培 养 箱 中 培 养 $ 9, ’CD后，体视显微镜下检查融合情况 $ ! # " # $ 重构胚的活化 采用化学方法对融合后的重 构胚进行活化 $ 重构胚在 =3>> 中培养 #2 （ A 从 !1!5 放入成熟培养液开始计时） 后开始活化 $ 具体步骤 是：重构胚在含 ?! ’(" ) * M#93&4 的 !O3JMM 培养液 中作用 2 ’CD，用 !O3JMM 培养液洗 9 遍后，移入含 （ !/P）Q 9 ! 3,! : ) ’* 放线菌酮 : ) ’* 细胞松弛素 6 （!6） 的 !O3JMM 培养液中 3 A $ 然后用 !O3JMM 培养 液洗 9 遍，移入含 3,! : ) ’* !/P 的 !O3JMM 培养液 中作用 2 A，取出重构胚，用 !O3JMM 培养液充分清 洗后，于 !O3JMM 培养液中进行体外培养 $ !#$ 重构胚的体外培养 共培养液滴的准备 共 培 养 前 一 天，将
>）操作卵子总数的百分比， @）融合总数的百分比，同列中有不 同字母上标者表示差异显著（ ! E ) ! )+） ! 9F99 软件进行统计分析
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重构胚的移植和出生情况
本实验共移植 "4# 头受体牛 ! 其中，荷斯坦奶 牛 4B 头，西门塔尔牛 B0 头 ! 移植 3 个月后获得妊 娠 #+ 头 ! 4 个月时，妊娠 "+ 头 ! 自 #))0 年 + 月份出 生首只 克 隆 母 牛 犊 截 止 到 发 稿 为 止，共 有 3 头 存 活!
融合条件进行探索 # 影响电融合的因素主要包括： 融合液的成分，脉冲强度，脉冲时程 # 我们的实验 比较了克隆牛过程中改变电融合条件对附植前胚胎
"$$&($%("" 收稿，"$$&(!!(") 收修改稿 （批准号：&*%&$"%$） 和新疆金牛生物股份有限公司资助项目 " 国家自然科学基金 联系人， ： +(,-./ 0123456 7-34-# .89# -0# 03 " "
第 !" 卷 于培养箱中培养 ! 使用前 "# $，将细胞培养液换成 胚胎培养液 %&"’((，培养箱中平衡待用 ! ! "# " $ 重构胚的体外培养 活化后的重构胚放入 %&"’(( 培养液中，") * "+ 枚 , "))! -，在 +. %/# ， 01 ! +2 ，饱和湿度的培养箱中培养 ! 31 $ 后，选择 分裂的胚胎移入含贴壁 %+45- , 6 鼠胎儿成纤维细胞 的液滴中共培养 ! 每隔 31 $ 将培养液更换一半 ! 体 外培养第 + 天，培养液中加入葡萄糖，使其终浓度 达到 " 78 , 7-! 培养第 4 和第 1 天分别记录囊胚的数 量! ! ! # ! % 胚胎移植 于重构胚发育的第4或第1天，将 形态良好的囊胚装入胚胎移植管中，每管装入 " * # 枚胚胎 ! 选择自然发情第 4 天的荷斯坦奶牛和西门 牛进行子宫移植 ! 塔尔 （ 9:7;<=>?）
%
讨论
克隆效率一直是动物克隆中首先考虑的问题 !
$ 结果
$ "! 不同的电场强度及电脉冲时程对体细胞融合 率及重组胚发育的影响 表 " 示 3 种融合方案对融合率和囊胚发育率都 无显著差异，但是囊胚发育率以方案 % 最高 ! 融合 后重构胚的死亡率以方案 ( 最高，比较可见到显著 差异 !
表!
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第 !" 卷
第#期
$%%" 年 # 月
!"，# $ %& ’’(" ) * +!"，& $ ,& ’’(" ) * -.# /012 和 3 $ 24 中$ ’’(" ) * +/# 012） ! $ ! $ " 卵母细胞的成熟培养 收集的 !1!5 用 6078 洗 9 遍，再用预温的成熟培养液 （含 3,! : ) ’* 促卵 泡激素 （ ;8/） ，3 ! （ */） ，3! : ) ’* 黄体生成素 : ) ’* 雌二醇，3,< 胎牛血清的 =3>>） 洗 9 遍，放入成熟 培养液中，每 3,,! * 液滴中放入 #, 枚 !1!5，覆盖 石蜡油，于 9& $ ?@ ，?< !1# ，饱和湿度的 !1# 培养 箱中培养 $ ! # ! # $ %!期卵母细胞的获得 成熟培养 3> A 后对 !1!5 进行脱卵丘细胞的操作 $ 将卵丘细胞已发生扩 展的 !1!5 放入含 , $ ?< 透明质酸酶的 6078 中，消 化 3 B # ’CD，将带有少量致密卵丘的卵母细胞移入 新鲜的 6078 中，用管 径 适 当 的 玻 璃 管 反 复 吹 吸， 去除剩下的卵丘细胞 $ 经 6078 洗 9 遍，在体视显微 镜下，选择排出第一极体的卵母细胞 $ !#& 体细胞培养
的 =# 操作液中 $ 用持卵针固定卵母细胞，使其第一 极体位于时钟 3# 点的位置 $ 去核针插入透明带下， 吸出第一极体及其下的部分胞质，然后用注射针吸 取一体细胞注入透明带下 $ ! # " # " 融合 完成核移植的卵在 9&$ ?@ 预热的 =3>> 中洗 # 遍，分别放入 9&$ ?@ 预热的 6J山梨醇电融合
肤，充分剪碎后按上述方法进行培养传代 $ !#" !#"#! 核移植程序 供体细胞的准备 培养 9 B 4 代的细胞作为
核移植的供体细胞 $ 细胞生长至 &,< B >,< 时，将 培养液换成含 , $ ?< ;!8 的饥饿培养液，血清饥饿 #
［?］ B ? F，诱导细胞进入 G, 期 $ 核移植前，用, $ #?<
克隆效率的提高与多种因素有关 ! 电融合是体细胞 核移植生产克隆动物中一个关键环节 ! 电融合是一 个较为复杂的生物物理学变化过程，其原理是：细 胞膜的通透性在外加直流电脉冲方波的作用下发生 改变，形成许多小孔洞，这些孔洞保留一定时间融 合成为大的穿孔 ! 如果两个紧密接触的细胞膜发生 穿孔和融合，则导致细胞质交流，最终合为一体 ! 细胞核移植技术根据这一原理完成供受体细胞的重 建过程 !
第 !" 卷
第#期
$%%" 年 # 月
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克隆牛过程中电融合条件对附植前胚胎发育的影响 !
第#期
表$
电融合 液类型 甘露醇 山梨醇
$%%" 年 # 月
ຫໍສະໝຸດ Baidu
+10
不同融合液对体细胞融合率及重组胚发育的影响
操作卵 子数量 ")# 4B 融合数 , . >） （+4 ! 1） +B （6# ! )） 3B 死亡卵数 量 , . @） （ + 1 ! +） （ + ") ! #） 囊胚数量 #’细胞 数量 , . @） , . @） （++ ! B） "" （"1 ! 6） 00 （6" ! #） 0) （ B "1 ! 0）
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克隆牛 核移植 电融合
自“多莉”羊诞生后，体细胞核移植技术成为 了当前生命科学研究领域的一个热门话题 # 但是目 前克隆技术的效率仍然很低 # 融合是由体细胞核移 植生产克隆动物的一个关键步骤，对融合条件进行 优化会提高成功生产克隆牛的效率，同时我们也对 在体外成熟的卵母细胞因电刺激所发生的物理化学 反应有进一步的了解 # 由于电融合对细胞的毒性小，
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衡 3 B # ’CD，移入电融合槽中，拨动卵，使体细胞 平行 $ 与卵母细胞的接触面与两电极 （间距 3 ’’） 融合的操作分为以下 2 种方案： （ 3&, N ) ’’， M：在电极之间通以两个直流脉冲 ； 3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） （ 3,, N ) ’’， 7：在电极之间通以两个直流脉冲 ； #,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） （ 32, N ) ’’， !：在电极之间通以两个直流脉冲 ； 3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） 6：施加直流电脉冲前先给予 ? N 交流电场预处 理数秒钟，然后在电极之间通以两个直流脉冲 （32, N ) ’’，3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） $ 融合操作后的卵子移入 =3>> 中洗 9 遍，置于 覆盖 石 蜡 油 的 =3>> 中， 于 !1# 培 养 箱 中 培 养 $ 9, ’CD后，体视显微镜下检查融合情况 $ ! # " # $ 重构胚的活化 采用化学方法对融合后的重 构胚进行活化 $ 重构胚在 =3>> 中培养 #2 （ A 从 !1!5 放入成熟培养液开始计时） 后开始活化 $ 具体步骤 是：重构胚在含 ?! ’(" ) * M#93&4 的 !O3JMM 培养液 中作用 2 ’CD，用 !O3JMM 培养液洗 9 遍后，移入含 （ !/P）Q 9 ! 3,! : ) ’* 放线菌酮 : ) ’* 细胞松弛素 6 （!6） 的 !O3JMM 培养液中 3 A $ 然后用 !O3JMM 培养 液洗 9 遍，移入含 3,! : ) ’* !/P 的 !O3JMM 培养液 中作用 2 A，取出重构胚，用 !O3JMM 培养液充分清 洗后，于 !O3JMM 培养液中进行体外培养 $ !#$ 重构胚的体外培养 共培养液滴的准备 共 培 养 前 一 天，将
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重构胚的移植和出生情况
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克隆效率一直是动物克隆中首先考虑的问题 !
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克隆效率的提高与多种因素有关 ! 电融合是体细胞 核移植生产克隆动物中一个关键环节 ! 电融合是一 个较为复杂的生物物理学变化过程，其原理是：细 胞膜的通透性在外加直流电脉冲方波的作用下发生 改变，形成许多小孔洞，这些孔洞保留一定时间融 合成为大的穿孔 ! 如果两个紧密接触的细胞膜发生 穿孔和融合，则导致细胞质交流，最终合为一体 ! 细胞核移植技术根据这一原理完成供受体细胞的重 建过程 !
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