环境对斑马鱼胚胎发育的影响

环境对斑马鱼胚胎发育的干扰
XXX,YYY,ZZZ
一、实验目的及原理：
1、通过斑马鱼早期发育过程的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识。

2、通过设置环境因子（锌离子）来研究其对斑马鱼胚胎发育的影响程度。

3、通过对比对照组和实验组，进一步巩固对硬骨鱼胚胎发育模式的认识。

4、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力。

5、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解。

二、实验材料与方法：
1、实验材料：
所需胚胎：发育良好的、健康的斑马鱼胚胎（原肠胚早期）36枚。

试剂：硫酸锌（分析纯），
器材：培养容器12孔板，恒温培养箱，显微镜，解剖镜，载玻片，塑料滴管，手表，移液枪100uL、1000uL，量筒100mL*2。

2、实验方法：
（1）在本实验中，使用硫酸锌作为实验用环境因子，共设三个梯度，分别为：0，0.1mg/L，1mg/L。

每个梯度设4个平行组，每个平行组3个胚胎，共需36个胚胎。

（2）实验处理起始时间：原肠胚早期：
实验处理终止时间：孵化期。

（3）实验操作：
A.挑选胚胎：
由于斑马鱼卵受精及发育的不均匀性，要对斑马鱼卵进行挑选。

挑选时要挑透明、无白色斑点、卵膜完整的。

之后的实验中还要不断将败育卵挑出。

用滴管（塑料滴管口部要剪短且一定要圆滑，并且直径要大于卵径）将选择好的卵依次吸出，然后放入12孔板中进行孵化。

【注意剔除异物眼观有白色小斑点、畸形异常卵。

】
B.实验体系：
12孔板培养胚胎，每孔放入3个胚胎，共使用12个孔，36个胚胎。

12个孔分别标上A1~A4,B1~B4,C1~C4。

A1~A4组作为对照组的三个平行组，B1~B4作为0.1mg/L组的三个平行组，C1~C4作为1mg/L组的三个平行组。

C.实验期间的培养管理：
1．孵化用水：
孵化水温一般要25~28℃，在这个温度范围内，温度越低，孵化所需时间相应越长。

水温25℃时，受精卵经48~72h孵出仔鱼，水温28℃时，经36h孵出仔鱼。

水温太高或太低，会造成受精卵死亡。

[2]
【实验中设定的培养温度为25℃，由于恒温培养箱的示数与实际温度有较大差异，而且在实验后期（80h）提高培养箱温度以加速孵化，所以本次实验实际中的温度并不恒定，暂以25℃为准。

】
2.孵卵卫生：
（1）定期观察，每12h换一次水，水温要相近，而且每次换水量在原水量的1/3-1/2,以尽量使胚胎缩短适应期，使发育流畅。

定期将死卵挑出，以确保不影响其他卵的正常发育。

3、观察记录：
（1）前3h实时观察、拍照并记录，之后每天早上(7:00-9:00)、中午(12:30-14:30)、晚上(18:00-21:00)三段时间对斑马鱼胚胎发育不同时期以及畸变进行观察、拍照并记录。

（2）实验指标:实验前，根据文献查询[3]，Zn2+可能导致的畸变有：
原肠胚期：胚胎可能因外包功能缺失而妨碍前后体轴的形成，导致卵黄外突和原肠外凸。

分裂期：胚胎可能发生严重的发育阻滞和神经管缺损，后者表现为尾部畸变，从而影响早期器官的形成。

成型期和孵化期：可导致心肌肿大、心率不稳、后主静脉血流缓慢或停止、神经管缺损、脊椎和尾部弯曲、色素沉积减少等。

（3）实验照片及记录：
A、对照组与实验组发育过程比较：
1、原肠期：由于实验照片不足，不能作出有价值的分析。

故省去。

下图依次是原肠早期、原肠晚期：摄于23-20：00
2、体节期：如下，各组间在相近时间内体节期胚胎的发育图比较。

A组：摄于24-10：35
B组：摄于24-10：10
C组：摄于24-10：22
3、咽期：各组间在相近时间内咽期胚胎的发育图比较。

A组：25-18：04
B组：25-18：15
C组：25-18：32
4、孵化期：各组间在相近时间内孵化期胚胎的发育图比较。

A组：摄于26-19：50
B组：摄于26-19：20
C组：摄于26-19：15
B、设计梯度和对照组，并各设平行试验3次。

（吸收[1]的图表模式）
4、计算及数据分析：
使用的数据处理方法：用直线内插法作图，使用软件测定不同浓度锌离子与对应斑马鱼胚胎发育影响程度的显著性概率，从而得出锌离子对斑马鱼早期胚胎发育的干扰的相关程度。

使用的处理软件：Excel软件。

三、实验结果：
（一）用硫酸锌做环境因子，在25℃的培养条件下：
对照组：
斑马鱼胚胎平均经过84.21h孵化出来。

实验组：
0.1mg/L的处理下，斑马鱼胚胎平均经过82.83h孵化出来；
1mg/L的处理下，斑马鱼胚胎平均经过82.19h孵化出来。

（二）对照组孵化率为100%，实验一组孵化率为91.7%，实验二组孵化率为83.3%。

（三）三个组均无明显的畸形胚胎产生。

（四）实验中各阶段胚胎的图片所示：
四、分析与讨论：
（一）对实验结果进行分析讨论，并阐述其中的原理。

1、本次实验中，斑马鱼胚胎发育的速度明显较相应的文献值慢。

分析：文献中，在25℃条件下，斑马鱼胚胎从受精卵到孵化出大约需要72h,而本实验平均孵化时间约83.1h，比文献值慢不少。

本实验中斑马鱼胚胎要不时的取出观察、拍照，而室温比恒温培养箱中的低，故较长时间的取出观察，使平均培养温度降低，这可能是本实验胚胎发育偏慢的一个原因；经过证实，实验用的恒温培养箱箱内实际温度比其示数明显要低，故实验设定的25℃培养条件就不准确了。

其他组的培养箱温度与示数较为一致，明显可感觉出温度比本实验所用的培养箱的温度高，而且这些组的斑马鱼与文献值较接近，比本实验组早孵化大约一天。

基本上可以说明本实验组培养温度偏低是导致斑马鱼发育较慢的主要原因。

2、在本次实验中，斑马鱼胚胎并没有明显的畸形产生，与文献中锌离子
的致畸作用不一致。

分析：文献中证明锌离子在浓度为20-30mg/L时，对斑马鱼的致畸作用较为明显，而实验中因为操作及器材等原因，只设置了对照、0.1mg/L 和10mg/L三个浓度梯度，而且浓度在较低水平，故而锌离子浓度偏低可能是实验胚胎无畸形出现的主要原因。

3、通过实验图片可以发现，在相同的时间点，实验组有较明显的发育较快
现象（见实验照片和记录：体节期、咽期）。

分析：通过实验图片的观察，我们可以较为清楚的发现在体节期、咽期阶段，锌离子浓度越高，胚胎发育越快。

与文献相结合可以推测：在较
低浓度条件下，锌离子有利于促进斑马鱼胚胎发育，在较高浓度条件下，锌离子会导致畸形。

4、对照组和实验一组、实验二组中三个组中死亡卵的个数依次为0、1、2。

实验数据呈线性关系，虽然可以说是随锌离子浓度的提高，卵的死亡率升高，但是死亡卵的个数较少，而且三个死卵都是在第二天死亡的，后两天均没有卵死亡，很可能是挑卵原因或者是随机原因，不太具有可信度，故不再用软件作图。

（二）实验系统缺陷分析：
本实验系统有一个缺陷，因为每组的斑马鱼数有限，而且要最终统计孵化率及孵化各个时期的斑马鱼形态变化，所以实验中不能人为地处理斑马鱼胚胎，尤其不能人为地致胚胎死亡。

除了在孵化期，其余各个个发育阶段，斑马鱼都是在卵膜以内，胚体弯曲，不能准确地观察、测定胚胎形态特征及变化，尤其是尾部的形态特征不能准确的观察。

各种实验文献中对斑马鱼胚胎的观察，基本上都是限定在某一发育阶段，因此在处理时都是将卵膜挑破，使胚胎舒展开再进行观察。

这样观察既准确又清晰、方便。

由于以上缺陷存在，故建议改进实验。

五、参考文献：
[1]陈桑，李朝红等斑马鱼实验室繁育系统的建立1672-3554
[2]陈宝增，李凤超等实验室斑马鱼的繁育与养殖技术071002
[3]周玉，杨振国等神仙鱼胚胎和仔鱼发育的初步观察130062
[4]谢恩义，何学福瓣结鱼的胚胎发育630715
[5]丁海，李荣庆梭鲈胚胎发育及仔鱼前期发育的初步观察100075
[6]任波，任幕莲等扁吻鱼胚胎及仔鱼发育的形态学观察150070；
830000；843000
[7]王彦怀，陶秉春等金头鲷胚胎发育的初步观察300221；300384；
300452
[8]叶露，吴玲玲等PFOS/PFOA对斑马鱼胚胎致毒效应研究
200092
[9]江景田，李秋等磁化水对家鱼胚胎发育的影响118000
[10]刘金兰，龚望宝等孵化水体pH值对异育银鲫胚胎发育的影响
434025
[11]谢仰杰，孙帼英等河川沙塘的胚胎和胚后发育以及温度对胚胎发育
的影响361021；200062
[12]易薇，梁姝等乐果对中华大蟾蜍受精及胚胎发育的影响100875
[13]端正花，张斌田等双酚A对斑马鱼胚胎发育阶段的毒性及生物蓄
积300071
[14]郑敏，朱琳五氯酚对斑马鱼胚胎的毒性效应研究300071
[15]戈志强，秦伟等重金属离子Pb2+、Cu2+、Cd2+对大银鱼胚胎发育与
仔鱼存活的影响215006。