斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达

　万方数据

复旦学报（医学版）２００６年１月，３３（１）

脏的发生与发育过程中的作用提供依据。

材料和方法

斑马鱼胚胎固定收集不同发育时期的ＡＢ野生型斑马鱼（购自俄勒冈大学，斑马鱼养殖系统从美国ＡｑｕａｔｉｃＨａｂｉｔａｔｓ公司引进）胚胎：６ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ—ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，受精后６ｈ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、２０、２４、３６、４８ｈｐｆ，用４％多聚甲醛溶液固定过夜（至少固定１２ｈ），保存于甲醇溶液中，置一２０℃备用。

引物设计与合成首先根据Ｇｅｎｂａｎｋ数据库查得斑马鱼Ｍｅｆ２ｃｃＤＮＡ序列（Ｇｅｎｂａｎｋ：３０５７５），以包含密码子１３１９～２３８５位的基因序列为ＲＮＡ探针序列，探针序列总长１０６６ｂｐ。ＲＮＡ探针的引物序列（由上海赛百盛生物有限公司合成）为：Ｆｏｒ—ｗａｒｄ：５＇－ＣＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣ一３Ｒｅｖｅｒｓｅ：５＇－ＣＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧ一３

ＰＣＲ扩增以斑马鱼基因组总ＤＮＡ为模板，用以上两条引物特异扩增ＲＮＡ探针序列。扩增条件为：９５℃预变性２ｍｉｎ，９５℃变性４５Ｓ，５７℃复性４５Ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，重复３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

合成反义ＲＮＡ探针将纯化的扩增产物连接到ｐＧＥＭ—Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ）中，然后转化到ＤＨ５ａ感受态菌株（博大泰克）中进行克隆。根据Ｈａｒｌａｎｄ的方法［４３抽提转染后的连接载体质粒（测序验证质粒中插入序列是否正确），ＮｏｔＩ内切酶（ＮＥＢ）酶切完全，以其为模板转录合成反义ＲＮＡ探针。

整体原位杂交取不同发育时期的胚胎，用１×ＰＢＳＴ溶液洗去多余的甲醇溶液，将胚胎置于６５℃水浴进行预杂交３ｈ，然后加入所合成的反义ＲＮＡ探针６５℃水浴杂交过夜。多余的探针用０．２×ＳＳＣ溶液洗去，加入ａｎｔｉ—Ｄｉｇ—ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）与反义ＲＮＡ探针结合过夜。未结合的抗体用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去，再加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＮＴＭＴ溶液显色３０ｍｉｎ，迅速用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去多余的显色液，在显微镜下观察并记录结果。

结果

探针合成效果琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，本实验中设计的引物能够特异性地扩增目标基因片段。图１Ａ为特异扩增的ＲＮＡ探针序列电泳检测结果，扩增的ＲＮＡ探针序列大小约１０６６ｂｐ。图１Ｂ为酶切后电泳迁移率的改变，２、３泳道是未被酶切的质粒序列，４、５泳道是酶切后的质粒序列。酶切后质粒电泳速率要比未酶切质粒的速率要快。同时，我们将该序列测序后进一步验证（由上海赛百盛生物有限公司测序），连接至ｐＧＥＭ—Ｔ载体中的ＲＮＡ探针的序列是正确的。

图ｌ凝胶分析ＰＣＲ结果（Ａ）和质粒酶切结果（Ｂ）Ｆｉｇ１ＧｅｌａｎａｌｙｓｉｓＰＣＲ（Ａ）ａｎｄｐｌａｓｍｉｄ（Ｂ）

Ａ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－５；ＲＮＡｐｒｏｂｅ．Ｂ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－３：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ—ｐＧＥＭＴ；

４－５：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ－ｐＧＥＭＴｂｙＮｏｔ－１

斑马鱼整体原位杂交在斑马鱼胚胎发育早期，Ｍｅｆ２ｃ在胚体中没有自身的转录产物，仅少许从母体自带的Ｍｅｆ２ｃｍＲＮＡ存在，胚体染色呈现为弥散均染状态（图２：ａ，ｂ见封二）。当胚胎逐步发育到１３ｈｐｆ，Ｍｅｆ２ｃ在体节中开始表达，此时约已形成８个体节，表现为在背侧出现两条条带状的深染部位；同时，在心脏中的表达也开始出现，在靠近头侧部出现有深染的片状区域，代表早期的生心区的细胞中有Ｍｅｆ２ｃ表达（图２：ｃｌ，ｃ２见封二）。当胚胎发育至１５ｈｐｆ时，体节以及心脏中Ｍｅｆ２ｃ的表达更加明显，Ｍｅｆ２ｃ在体节的表达表现为各个体节之间能清晰区分，并表现为典型的Ｖ型结构；同时，心脏中的表达表现为生心区细胞开始集中，逐步靠近体轴开始形成心管结构，体现出染色更为集中，由片状染色转变成为线状（图２：ｄｌ，ｄ２见封二）。随着胚胎进一步发育，体节逐步完善，心管逐步形成，Ｍｅｆ２ｃ仍然保持较高的转录水平，体节中表现为随着体节的增多，Ｖ型染色的体节也随之增多；在心脏的表达呈现出明显的线管状结构（图２：ｅ，ｆ见封

－－）。斑马鱼的胚胎发育随着时间的进展而逐步完　万方数据

　万方数据

图１

Ｆｉｇ１图２Ｆｉｇ２图３Ｆｉｇ３图４Ｆｉｇ４

斑马鱼胚胎发育过程Ｍｅｆ２ｃ表达

（正文见第８９页）

图２Ｍｅｆ２ｃ基因在斑马鱼胚胎中的表达

Ｆｉｇ２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｅｆ２ｃｉｎｔｈｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈ

ａ：６ｈｐｆ；ｂ：１２ｈｐｆ；Ｃ１，ｃ２：１３ｈｐｆ；ｄｌ，ｄ２：１５ｈｐｆ；ｅ：２０ｈｐｆ；ｆ２４ｈｐｆ；９１．９２：４８ｈｐｆ

Ｂｌａｃｋａｒｒｏｗ：ｅｍｂｒｙｏ；Ｒｅｄａｒｒｏｗ：ｈｅａｒｔ；Ｙｅｌｌｏｗａｆｒｏｗ：ｓｏｍｉｔｅ

玫瑰糠疹皮损中朗格汉斯细胞的超微结构

ＬＣ在ＰＲ表皮中的表达

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣｉｎＰＲｅｐｉｄｅｒｍｉｓ（ＤＡＢｓｔａｉｎｉｎｇ×４００）

ＬＣ在ＰＲ真皮中的表达

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣｉｎＰＲｄｅｒｍｉｓ（ＤＡＢｓｔａｉｎｉｎｇｘ４００）

ＰＲ皮损中ＬＣ的Ｂｉｒｂｅｃｋ颗粒

ＢｉｒｂｅｃｋｇｒａｎｕｌｅｓｉｎＬＣｏｆＰＲ（ＴＥＭ×２００００）

ＰＲ皮损中ＬＣ的线粒体和粗面内质网

（正文见第１１０页）ＣｈａｎｇｅｓｏｆｒｏｕｇｈｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｉｎＬＣｏｆＰＲ（ＴＥＭ×３０

０００）　万方数据

斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达

作者：刘学飞， 王跃祥， 蒋璆， 钱林溪， 高广文， 董永新， 钟涛， 宋后燕， LIU Xue-fei ， WANG Yue-xiang， JIANG Qiu， QIAN Lin-xi， GAO Guang-wen， DONG Yong-xin，

ZHONG Tao， SONG Hou-yan

作者单位：刘学飞,王跃祥,蒋璆,钱林溪,高广文,董永新,宋后燕,LIU Xue-fei,WANG Yue-xiang,JIANG Qiu,QIAN Lin-xi,GAO Guang-wen,DONG Yong-xin,SONG Hou-yan(复旦大学上海医学院生物

化学与分子生物学系-分子医学教育部重点实验室,上海,200032)， 钟涛,ZHONG Tao(美国

Vanderbilt大学医学院心血管研究室,TN 37027)

刊名：

复旦学报（医学版）

英文刊名：FUDAN UNIVERSITY JOURNAL OF MEDICAL SCIENCES

年，卷(期)：2006,33(1)

1.Lin Q;Schwarz J;Bucana C Control of mouse cardiac morphogenesis and myogenesis by transcription factor Mef2c[外文期刊] 1997

2.Srivastava D;Olson EN A genetic blueprint for cardiac development[外文期刊] 2000

3.Black BL;Olsen EN Transcriptional control of muscle by myocyte enhancer factor-2 (MEF-2) protein [外文期刊] 1998

4.Harland RM;Kay BK;Peng HB In situ hybrization:an improved whole-mount method for Xenopus embryos [外文期刊] 1991

5.Warren KS;Fishman MC"Physiological genomics":mutant screens in zebrafish[外文期刊] 1998

6.徐振华;赵慕军;李载平斑马鱼与人类疾病模型的研究[期刊论文]-生命的化学 2002(04)

7.Skerjanc IS;Ptropoulos H;Ridgeway AG Myocyte Enhancer Factor 2C and Nkx2-5 Up-regulate Each

Other's Expression and Initiate Cardiomyogenesis in P19 Cells[外文期刊] 1998(52)

8.Wang DZ;Valdez1 MR;McAnally R The Mef2cgene is a direct transcriptional target of myogenic bHLH and MEF2 proteins during skeletal muscle development 2001

9.Liu ZP;Nakagawa O;Nakagawa M CHAMP,A Novel Cardiac-Specific Helicase Regulated by Mef2c 2001

10.Razeghi P;Young ME;Cockrill TC Downregulation of myocardial myocyte enhancer factor 2c and myocyte enhancer factor 2c-regulated gene expression in diabetic patients with nonischemic heart failure[外文期刊] 2002

11.Baruch ST;Didier YRS;Mark CF Three zebrafish MEF2 genes delineate somatic and cardiac muscle development in wild-type and mutant embryos 1996

1.周云.何晓宇.ZHOU Yun.HE Xiao-yu转录因子GATA-4在人胎心发育中的表达[期刊论文]-医学研究生学报2008,21(4)

2.周文.冯湘玲.杨旭宇.王磊.姚开泰DIG标记DNA探针检测noggin在爪蟾胚胎中的表达[期刊论文]-生命科学研究2002,6(3)

3.张立凤.桂永浩.钟涛.王跃祥.蒋球.崇梅.孙淑娜.宋后燕.ZHANG Li-feng.GUI Yong-hao.ZHONG Tao.WANG Yue-xiang.JIANG Qiu.CHONG Mei.SUN Shu-na.SONG Hou-yan视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏房室分化[期刊论文]-复旦学报（医学版）2007,34(1)

4.李艳欢.吴新荣斑马鱼整体原位杂交法研究MMP15a的发育相关表达的初步观察[期刊论文]-生物学杂志

2009,26(6)