斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色

斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色

斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。

实验步骤：

1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一

种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。

使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。

2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。

3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。

丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。

4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。

5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。

6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。

7. 用封闭液清洗胚胎2次。

8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。加入合适浓度的一抗。

一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。

9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。

根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。

10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。

11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。

12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。

13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。

14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。

15. 爬片观察胚胎：观察分析前样品于4°C避光储存。

爬片：用融化的含1%琼脂糖的PBS爬片。一旦加入琼脂糖后，用含70%甘油的PBS 覆盖琼脂糖，再在样品上放置一个盖玻片。