研究生免疫组织化学染色技术精品PPT课件
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• （2）肿瘤细胞异常表达： 可选用多种标记去证
实或排除，鉴别其真正组织来源或向某一组织细 胞分化。
• （3）肿瘤细胞吞噬组织抗原：是由于某些恶性肿
瘤细胞摄入周围正常组织细胞成分，虽然后者也 存在某些抗原，但不属于瘤细胞固有成分，胞浆 内抗原定位较模糊，因此应该区别。
• （4）非特异性染色 是指抗原无明确定位，
• 2.胞核型 阳性颗粒定位于细胞核，呈均
匀分布或位于核膜下，有的呈小斑块状 不规则分布。此多见于增殖细胞核抗原、 Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、 孕激素受体（PR）和基因p53等。
• 3.胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗
原均属于此种类型，如细胞角蛋白、波形蛋白、结 蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶 及前列腺特异性抗原（PSA）等。依据抗原在胞浆 内分布形式，通常表现为弥漫性分布或局限性分布。 前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆。局 限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞 浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧。
• 7.菊团型 阳性肿瘤细胞排列呈菊团样结
构，部分阳性细胞围绕血管排列。此型 多见于分化较好的神经内分泌肿瘤和胶 质细胞瘤等，阳性颗粒定位在细胞浆。
四、阳性标记强度特征
• 细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色
程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性； 也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大 致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳 性，阳性细胞25%~50%；强阳性，阳性 细胞>50%。
肿瘤细胞与间质细胞、细胞与间质均为黄 色，相互累及一片，色度无深浅之分。这 种标记组织片不能作为免疫组织标记结果 判断依据。
• 非特异性染色的原因常为组织标本固定不佳、抗
体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。 因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，如前 所述，阳性颗粒应位于细胞胞膜、胞浆或胞核， 阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深 浅不一。如果缺乏细胞间的不均一性染色，即是 呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另组织片 边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊 断依据。
免疫组织化学染色技术PPT课件
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
2-1 免疫组织化学技术PPT课件
能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗 原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类 脂都属于半抗原。
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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21
PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组织化学技术PPT演示课件
6
实验设备
恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包 埋机、切片机、摊片机、烤片机、 冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以 及离心机和免疫组化试剂等
7
8
9
脱水机、石蜡包埋机
10
免疫组化技术分类
1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
11
酶联免疫组织化学
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
15
二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶连结）三步法染色步骤
1、脱蜡、水化
• 60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 • 100%的绝对乙醇:2×5分钟; • 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 • 80% ethanol 2 minutes； • 70% ethanol 2 minutes； • distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 • PBS洗3次×3 min。
• （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
18
14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水
50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片 盖上）、镜检
11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室 温或37℃孵育30min-1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min
实验设备
恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包 埋机、切片机、摊片机、烤片机、 冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以 及离心机和免疫组化试剂等
7
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脱水机、石蜡包埋机
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免疫组化技术分类
1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
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酶联免疫组织化学
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
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二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶连结）三步法染色步骤
1、脱蜡、水化
• 60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 • 100%的绝对乙醇:2×5分钟; • 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 • 80% ethanol 2 minutes； • 70% ethanol 2 minutes； • distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 • PBS洗3次×3 min。
• （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
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14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水
50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片 盖上）、镜检
11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室 温或37℃孵育30min-1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min
研究生课程细胞免疫组织化学特殊染色方法及ppt图片演示
细胞免疫组织化学 特殊染色方法
特殊染色用于显示标本中的一些结构， 使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.
特殊染色 单一特殊染色 一种染料对一种组织 结构或细胞进行染色 复合特殊染色 多种染料对多种组 织结构或细胞进行 染色
糖原染色方法：
糖原为细胞内的多糖或粘多糖， 肝细胞和肌细胞内的糖原最多。 糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。 例如： 先天性糖代谢紊乱-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、 淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内 都可聚集过多的糖原。
（1）切片脱蜡至水； （2）入0.5%碘乙醇5-10min， 自来水洗，蒸馏水洗； （3）入0.5%硫代硫酸钠3-5min； （4）Weigert 铁苏木精10-20min，自来水洗； （5）1%盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；
（6）入丽春红酸性品红液3-5min，蒸馏水速洗； （7）入1%磷酸钼水溶液5min； （8）倾去磷酸钼，直接用2%亮绿液染3-5min；
Masson ′ s三色染色法显示胶原纤维
1、取材：皮下组织或肠系膜铺片 2、固定：Zenker\Bouin\ 10%中性福尔马林缓冲液
3、染液配制
（1）Weigert铁苏木精
A液：苏木精 10g, 95%乙醇100ml B液：29%三氯化铁水溶液 4ml 25%盐酸 1ml 蒸馏水 95ml 用时甲乙两液等份混合，只能用数天。
疏松结缔组织各种成分显示方法：
疏松结缔组织中含有：
胶原纤维、弹性纤维、网状纤维； 巨噬细胞、肥大细胞。
一、 网状纤维
分布：肝、肾、脾、淋巴结等器官内。
纤维直径0.2-2.0µ m，分支多，交织 成网。 网状纤维主要由Ⅲ型胶原蛋白组成，表 面被覆糖蛋白，在镀银切片呈黑色称为 嗜银纤维。
Gomoris镀银法显示网状纤维 1、取材：淋巴结 2、试剂配制 （1）硝酸银溶液： 硝酸银 10.2g，溶于100ml蒸馏水。 （2）氢氧化钠溶液： 氢氧化钠 3.1g，溶于100ml蒸馏水。
特殊染色用于显示标本中的一些结构， 使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.
特殊染色 单一特殊染色 一种染料对一种组织 结构或细胞进行染色 复合特殊染色 多种染料对多种组 织结构或细胞进行 染色
糖原染色方法：
糖原为细胞内的多糖或粘多糖， 肝细胞和肌细胞内的糖原最多。 糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。 例如： 先天性糖代谢紊乱-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、 淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内 都可聚集过多的糖原。
（1）切片脱蜡至水； （2）入0.5%碘乙醇5-10min， 自来水洗，蒸馏水洗； （3）入0.5%硫代硫酸钠3-5min； （4）Weigert 铁苏木精10-20min，自来水洗； （5）1%盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；
（6）入丽春红酸性品红液3-5min，蒸馏水速洗； （7）入1%磷酸钼水溶液5min； （8）倾去磷酸钼，直接用2%亮绿液染3-5min；
Masson ′ s三色染色法显示胶原纤维
1、取材：皮下组织或肠系膜铺片 2、固定：Zenker\Bouin\ 10%中性福尔马林缓冲液
3、染液配制
（1）Weigert铁苏木精
A液：苏木精 10g, 95%乙醇100ml B液：29%三氯化铁水溶液 4ml 25%盐酸 1ml 蒸馏水 95ml 用时甲乙两液等份混合，只能用数天。
疏松结缔组织各种成分显示方法：
疏松结缔组织中含有：
胶原纤维、弹性纤维、网状纤维； 巨噬细胞、肥大细胞。
一、 网状纤维
分布：肝、肾、脾、淋巴结等器官内。
纤维直径0.2-2.0µ m，分支多，交织 成网。 网状纤维主要由Ⅲ型胶原蛋白组成，表 面被覆糖蛋白，在镀银切片呈黑色称为 嗜银纤维。
Gomoris镀银法显示网状纤维 1、取材：淋巴结 2、试剂配制 （1）硝酸银溶液： 硝酸银 10.2g，溶于100ml蒸馏水。 （2）氢氧化钠溶液： 氢氧化钠 3.1g，溶于100ml蒸馏水。
免疫组化技术课件课件精选课件
色
色
阳性细胞的染色特征：
①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面
②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一
④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
第二十六页，本课件共有45页
第三十七页，本课件共有45页
免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则： ①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。
②免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。
③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。
④免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为 准。
第四页，本课件共有45页
显示物： ➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用， 可形成不同颜色的终产物。用新品红（New fuchsine） 显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色 沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
前列腺特异性抗原（PSA）： 甲胎蛋白（AFP）：
甲状腺球蛋白（Tg）：
第三十页，本课件共有45页
软组织标记
软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，
肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。
肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中
肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种
免疫组织化学与组织学相关技术课件(研究生)第二章(1) 免疫组织化学技术
相应试剂
免疫反应
（特异性灵敏性） （颜色直观）
IHC科研应用：研究目标基因/蛋白 在细胞中的表达分布与功能
例如：
A. 表达于细胞核；
B、表达于胞浆
IHC科研应用：研究目标基因/蛋白 在组织中的表达分布、功能…
IHC临床应用： 肿瘤鉴定、分型等
1. “未分化”恶性肿瘤的确定
Ki-67：增殖
相关核抗原， 与有丝分裂密 切相关
ALP + BCIP——水解产物 + NBT—— NBT formation沉淀
（四）切片的附贴：特别加强
1.载玻片及盖玻片的处理：干净，避免抗原干扰 2.切片的附贴：避免染色过程中切片脱落。
免疫组化染色过程较长 含表面活性剂的缓冲液PBS多次浸泡冲洗切片 有的石蜡切片染色前要抗原修复（热、高压）
常用附贴剂： 1)甘油-明胶 2)多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)：最常用 3）APES：现配现用，垂直烤片（气泡） 4）APES和多聚赖氨酸联合：特别易脱落的组织切片
例如： 乳腺癌——特定分型、靶向药物
Luminal A型（ER/PR+, Her2-）,预后最好,内分泌治疗(±化疗) Luminal B 型（ER /PR +，Her2 +）,预后较好,化疗+内分泌治疗+靶向治疗
…….
《免疫组织化学技术》主要内容
免疫组化相关的组织学/细胞学技术 免疫酶组织化学技术 亲和免疫组织化学技术 免疫荧光组织化学技术
人子宫颈Ki67 IHC染色 ——宫颈癌
IHC临床应用：肿瘤鉴定、分型等
2. 转移肿瘤的原发部位
例如： 角质蛋白丝Keratin——上皮性肿瘤 波形蛋白丝Vimentin——间充质分化而来 结蛋白丝Desmin——肌肉肿瘤 神经丝NF——神经元 神经胶质丝GFAP——神经胶质瘤
免疫反应
（特异性灵敏性） （颜色直观）
IHC科研应用：研究目标基因/蛋白 在细胞中的表达分布与功能
例如：
A. 表达于细胞核；
B、表达于胞浆
IHC科研应用：研究目标基因/蛋白 在组织中的表达分布、功能…
IHC临床应用： 肿瘤鉴定、分型等
1. “未分化”恶性肿瘤的确定
Ki-67：增殖
相关核抗原， 与有丝分裂密 切相关
ALP + BCIP——水解产物 + NBT—— NBT formation沉淀
（四）切片的附贴：特别加强
1.载玻片及盖玻片的处理：干净，避免抗原干扰 2.切片的附贴：避免染色过程中切片脱落。
免疫组化染色过程较长 含表面活性剂的缓冲液PBS多次浸泡冲洗切片 有的石蜡切片染色前要抗原修复（热、高压）
常用附贴剂： 1)甘油-明胶 2)多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)：最常用 3）APES：现配现用，垂直烤片（气泡） 4）APES和多聚赖氨酸联合：特别易脱落的组织切片
例如： 乳腺癌——特定分型、靶向药物
Luminal A型（ER/PR+, Her2-）,预后最好,内分泌治疗(±化疗) Luminal B 型（ER /PR +，Her2 +）,预后较好,化疗+内分泌治疗+靶向治疗
…….
《免疫组织化学技术》主要内容
免疫组化相关的组织学/细胞学技术 免疫酶组织化学技术 亲和免疫组织化学技术 免疫荧光组织化学技术
人子宫颈Ki67 IHC染色 ——宫颈癌
IHC临床应用：肿瘤鉴定、分型等
2. 转移肿瘤的原发部位
例如： 角质蛋白丝Keratin——上皮性肿瘤 波形蛋白丝Vimentin——间充质分化而来 结蛋白丝Desmin——肌肉肿瘤 神经丝NF——神经元 神经胶质丝GFAP——神经胶质瘤
免疫组织化学技术-精品医学课件 (2)
SA是一种从链酶菌Streptomyces Avidinii 培养物
中提取的蛋白质。也有四个生物素结合位点，是一 种亲和力更高的生物素结合蛋白。 SABC复合物： 链酶亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后形成 链酶亲和素－生物素－酶复合物（SABC）。 这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和 素结合位点，可以和各种生物素标记的抗体结合。
ABC法显示小鼠胸腺IL-6阳性细胞
（Question：胸腺的结构？功能？细胞？）
阳性细胞（巨噬细胞）胞质棕黄色， 细胞核绿色（甲基绿）
5.注意事项
（1）内源性生物素活性及其消除：
内源性生物素活性: 某些组织和细胞(肾小管上皮细胞， 肝细胞、唾液腺的纹状管上皮细胞、白细胞、乳腺等)具有 较强生物素活性，使用本法染色时，会与抗生物素结合而产 生非特异性染色.
特点：亲和素作为“桥”，将生物素化的抗体与生物素化的 酶(HRP)连接起来。与PAP法相似，共有三个抗体：
原理： + 第一抗体（未标记的相关抗原特异性抗体） + 第二抗体（生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合） + 生物素-亲和素-过氧化物酶复合物ABC （剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结合） + 底物，显色反应
CSA 法 原 理 图
CSA法优缺点
优点：
比EnVision法敏感20～100倍。 适合于实验病理学和第一抗体昂贵（敏感，可稀释相当
高）、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原 量较少的组织细胞抗原的检测方法。 核内抗原的检测（原为杂交）。
缺点：
操作步骤多、孵育时间长。 存在严重的内源性干扰（内源性生物素、过氧化物酶、
剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结 + 底物，显色反应
中提取的蛋白质。也有四个生物素结合位点，是一 种亲和力更高的生物素结合蛋白。 SABC复合物： 链酶亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后形成 链酶亲和素－生物素－酶复合物（SABC）。 这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和 素结合位点，可以和各种生物素标记的抗体结合。
ABC法显示小鼠胸腺IL-6阳性细胞
（Question：胸腺的结构？功能？细胞？）
阳性细胞（巨噬细胞）胞质棕黄色， 细胞核绿色（甲基绿）
5.注意事项
（1）内源性生物素活性及其消除：
内源性生物素活性: 某些组织和细胞(肾小管上皮细胞， 肝细胞、唾液腺的纹状管上皮细胞、白细胞、乳腺等)具有 较强生物素活性，使用本法染色时，会与抗生物素结合而产 生非特异性染色.
特点：亲和素作为“桥”，将生物素化的抗体与生物素化的 酶(HRP)连接起来。与PAP法相似，共有三个抗体：
原理： + 第一抗体（未标记的相关抗原特异性抗体） + 第二抗体（生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合） + 生物素-亲和素-过氧化物酶复合物ABC （剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结合） + 底物，显色反应
CSA 法 原 理 图
CSA法优缺点
优点：
比EnVision法敏感20～100倍。 适合于实验病理学和第一抗体昂贵（敏感，可稀释相当
高）、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原 量较少的组织细胞抗原的检测方法。 核内抗原的检测（原为杂交）。
缺点：
操作步骤多、孵育时间长。 存在严重的内源性干扰（内源性生物素、过氧化物酶、
剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结 + 底物，显色反应
《免疫学》免疫组织化学的应用ppt课件
05
免疫组织化学的优缺点与展望
优点
高特异性
免疫组织化学技术能够针对特 定的抗原进行高特异性识别，
减少非特异性染色。
高灵敏度
通过使用酶或其他标记物，可 以检测到极低浓度的抗原，提 高检测灵敏度。
定位准确
通过标记特定抗体，可以精确 定位抗原在组织中的位置，有 助于疾病的诊断和病理研究。
多参数同时检测
《免疫学》免疫组织 化学的应用ppt课件
contents
目录
• 免疫组织化学概述 • 免疫组织化学的基本原理 • 免疫组织化学在病理诊断中的应用 • 免疫组织化学在研究中的应用 • 免疫组织化学的优缺点与展望
01
免疫组织化学概述
定义与特点
定义
免疫组织化学是一种利用抗原-抗体 反应原理，通过标记抗体来检测和定 位组织或细胞内特定抗原物质的技术 。
成本较高
需要针对不同的抗原制备特定的抗体 ，因此成本较高。
展望与未来发展方向
优化技术流程
多技术联合应用
通过改进实验流程和缩短实验时间，提高 实验效率和准确性。
将免疫组织化学与其他技术如基因测序、 蛋白质组学等相结合，以更全面地了解组 织样本中的分子表达情况。
自动化与标准化
临床应用拓展
开发自动化免疫组织化学分析系统，实现 标准化操作，减少人为误差。
20世纪80年代
建立了免疫酶标技术，提高了检测的灵敏度 和特异性。
20世纪70年代
建立了免疫荧光技术，成为最早的免疫组织 化学技术。
20世纪90年代至今
免疫组织化学技术不断改进和完善，应用范 围不断扩大。
02
免疫组织化学的基本原理
抗原-抗体反应
抗原和抗体结合的特异性
相关主题
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3.颗粒性显色
DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
29
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
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显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
武性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
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染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
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抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。
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实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
染色前处理 －预防脱片
常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度
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染色前处理 －包埋与切片
包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时
（迈新）；或60℃过夜
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(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
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S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
染色前处理 －切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
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染色前处理 －脱腊
原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
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实验操作中的应用
抗原修复 实验操作中的注意事项
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抗原修复
影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
免疫组织化学技术的定义
免疫组织化学技术 (Immunohistochemistry, IHC)是用标记 的特异性抗体（或抗原）对组织内的抗 原（或抗体）的分布进行定位、定性、 定量检测，经过组织化学呈色反应在组 织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋 白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门 新技术。
免疫组织化学的应用
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冲洗
一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20
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一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
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结果分析
1.特定的定位
胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥 散性。
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CK10
免疫组化标准化照片
ER
CD44v6
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2.染色的不均一性
阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在 分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量 的多少。
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人肝癌中EGFR的表武达汉大学病理教研室
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7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育 过夜， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵 育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min ； 10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液， 光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗， 苏木素复染； 11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取 代第一抗体，其余步骤相同。
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
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内源性过氧化物酶的灭活
存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞
消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟
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血清封闭
目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用
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复染
原则：注意两者之间对比，突出阳性信号
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实验对照设计
原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照
编号 阳性片 待检片 阴性对照
结论
1
－
－
－ 操作失误，抗体失效
2
＋
＋
＋
非特异性着色
3
－
＋
－
阳性片不含靶抗原
4
＋
－
－ 待检片不含定位抗原
5
＋
＋
－
待检片含定位抗原
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