《中国药典》2015年版微生物基本知识解析
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2015版中国药典四部微生物限度
2015版中国药典四部微生物限度中国药典是我国医药行业的重要规范，其中微生物限度是其中一个关键内容。
微生物限度是指药品中允许存在的微生物数量的上限。
它对药品的质量和安全性提出了严格要求。
2015版中国药典中明确了药品微生物限度的标准和方法，以保障药品的质量和使用的安全性。
一、微生物限度的定义和意义微生物限度是指在药品中存在的微生物数量的上限。
它是衡量药品质量和安全性的重要指标之一。
由于微生物对人体健康有潜在的危害，药品中过多的微生物污染可能导致药品的变质和降解，甚至引起严重的药品安全问题。
因此，微生物限度的控制是确保药品质量和安全性的关键步骤之一。
二、微生物的限度标准和分类微生物限度的标准和分类在2015版中国药典中得到了详细说明。
根据药品的特性和用途不同，微生物限度标准和分类也有所差异。
常见的微生物限度分类包括细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
各类微生物的限度标准和方法在药典中都有详细描述，以确保药品的质量和安全性。
三、微生物限度的检测方法为了准确检测微生物限度，2015版中国药典提供了一系列的微生物检测方法。
常见的方法包括菌落总数的测定、大肠菌群的测定、霉菌和酵母菌的测定等。
这些方法要求检测人员具备专业的技术和操作能力，确保检测结果的准确性和可靠性。
四、微生物限度的控制措施为了保证药品的质量和安全性，生产企业需要采取一系列的控制措施来控制微生物限度。
这些措施包括原料和辅料的检验、生产环境的控制、生产工艺的严格执行和产品的质量控制等。
通过全面有效的控制措施，企业可以确保药品的微生物限度在合理的范围内，从而保证药品的质量和安全性。
五、微生物限度的意义和前景微生物限度的控制是保障药品质量和安全性的重要手段，它直接影响着人们的生命健康。
随着人们对药品质量和安全性的要求越来越高，对微生物限度的控制也越来越严格。
中国药典不断完善微生物限度标准和方法，为药品生产和使用提供了规范和指导。
未来，微生物限度的研究和控制将成为药品质量控制的重要方向。
2015版中国药典微生物限度解析
10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
《2015版《中国药典》微生物检测与洁净室环境检测技术》-1
育
飞
天
教
育
微生物细胞结构示意图
• 细菌细胞结构图 •
教 真菌细胞结构图 天 飞
育
飞
天
教
育
微生物的五大共性
飞
天
教
育
1、体积小，面积大； 2、吸收多，转化快；
3、生产旺，繁殖快；
4、适应强，易变异； 5、分布广，种类多。
飞
天
教
育
细 菌 形 态 特 征
• 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较
天
教
育
试管
移液管
先用少许棉花塞于吸口端，然后用纸包好或装入金属吸 管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干。
飞
天
教
育
培 养 基 的 基 础 知 识
溶
液体培养 基用滤纸 过滤，固 体培养基 用纱布块 中夹薄层 脱脂棉过 滤
化
校正酸碱度
（1）先将卵磷脂加入少量蒸馏水低温加 热溶解溶、再加吐温80混匀，，加入琼 脂，静置15分钟。
细胞壁结构 G＋ G－
飞
天
教
育
脂多糖（LPS）,包括脂
厚度 强度 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 脂多糖
20－80nm 坚韧 约45％ 约2％ 无
10－15nm 疏松 约15％ 约20％ 有 有
蛋白A，核心多糖和特异
性多糖三个部分。LPS对 动物具有毒性作用，它 牢固地结合在细胞表面，
只在菌体融解时才释放，
非细胞类：病毒、亚病毒(类病毒、朊病毒)
飞
天
教
育
细菌（bacteria）
• 细菌是单细胞的原核微生物
• 细菌是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有 5×10的三十次方个。 • 细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成 • 根据形状分为三类，即：球菌、杆菌和螺形菌（包括弧菌、 螺菌、螺杆菌）
2015版中国药典微生物限度解析
微生物限度检查法
《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录： – 1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 – 2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 – 3、非无菌药品微生物限度标准
1.非无菌产品微生物限度检查： ----微生物计数法
1.1 总则：环境、要求 1.2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适 宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温 时,应均匀加热,且温度不应超过 45℃。供试 液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1小 时。
– 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试 液制备方法经确认均不适用，应建立其他适 宜的方法。
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平 均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对 照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培 养基管比较，试验菌应生长良好。
• 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动 检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定 的检查方法。
不适用于活菌制剂的检查
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】【 20版：不低于 D级背景下的生物安全柜或B级洁净区域内进行】 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录： – 1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 – 2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 – 3、非无菌药品微生物限度标准
1.非无菌产品微生物限度检查： ----微生物计数法
1.1 总则：环境、要求 1.2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适 宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温 时,应均匀加热,且温度不应超过 45℃。供试 液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1小 时。
– 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试 液制备方法经确认均不适用，应建立其他适 宜的方法。
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平 均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对 照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培 养基管比较，试验菌应生长良好。
• 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动 检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定 的检查方法。
不适用于活菌制剂的检查
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】【 20版：不低于 D级背景下的生物安全柜或B级洁净区域内进行】 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
2015版《中国药典》微生物检查法控制菌检查法修订解析
养18-24h。
• （4）结果判断：
• 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为 阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，查表判断1g或1ml 供试品中含耐胆盐革兰阴性菌的最大可能数。
五、供试品检查
• “未检出试验”与“定量试验”结论
• 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数
各供试品量的检查结果 每1g（或1ml）供试 品种可能的菌数（N）
• 4、结果判断方式：在各控制菌项下，生化 实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定试 验。”改为较少的生化实验或“采用其它适用要求
控制菌检查法适用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生 物。
当本法用于检查非无菌制剂及原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下 列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
三、培养基适用性
1、对照培养基
（5）尽量临用现配，培养基灭菌后，尽快取出，切忌在 高压锅内过夜存留，固体培养基灭菌或融化后，融化状 态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境
2～25℃保存，但不应超过21d；固体琼脂培养基熔化再
使用应不超过1次。 （6）干粉培养基或培养基原料变质再用；预制培养基储存
（铜绿+/大肠选-）1择8-72性h 増菌培养基培养，可以使受伤的细菌得到修复，提 高检出率。
三、培养基适用性
4、适用性检查
控制菌检查
耐胆盐革兰阴性菌
大肠埃希菌
沙门菌
铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
培养基
肠道菌増菌肉汤
紫红胆盐葡萄糖琼脂 麦康凯肉汤
麦康凯琼脂 RVS増菌肉汤
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂
三、培养基适用性
4、适用性检查
（3）根据每个控制菌检查的培养基逐个说明，控制菌检查用培养 基适用性检查的过程。
15版《中国药典》微生物学检验技术实施指导与修订解读
〈２０１５年版〉基本与ＩＣＨ微生物检查法接轨，涵盖标准和方 法的整体变化。
一、15版药典结构—总述
药典由原来的三部改为四部，预计15年7月颁布执行： 其中一部、二部、三部分别为中药、化药、生物药， 四部：中国药典2015版总则，主要包括：
凡例：主要增加对检测方法适用性、制剂通则、辅料 标准适用性等的要求
杨凌化药质量部ＱＣ周国娟 电话：15991721352 2015.04.21
目录
一、15版药典结构； 二、非无菌产品微生物检查； 2.1微生物计数法 2.2控制菌检查法 2.3微生物限度标准 三、微生物实验室质量控制内容； 3.1实验菌株的质量控制 3.2培养基的质量控制实验 3.3微生物鉴定技术 四、制药用水的检验及修订内容； 五、药品微生物实验室规范指导原则增修订的内容
2.1微生物计数法
定义：系指对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和 真菌的计数，不适用于活菌制剂的检查。本法 适用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准。
2015版 1105非无菌产品微生物限度检查--微生物计数 法
2.1微生物计数法
1、试验环境
操
2、供试液制备
作
流
3、培养基配制
1、根据供试品的理化特性与生物学特性，来制备供 试液。常用的制备方法详见“通则1105非无菌产 品微生物限度检查--微生物计数法”中规定。其 中不同于10版药典就是缓冲液、某些样品量的规 定有所变化；
2、供试液的浓度，按照方法确认的结论进行确定；
3、供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不 应超过45℃；
程
4、试验方法选择
5、培养计数及结果报告
2.1微生物计数法—试验环境
项目
检测 环境
一、15版药典结构—总述
药典由原来的三部改为四部，预计15年7月颁布执行： 其中一部、二部、三部分别为中药、化药、生物药， 四部：中国药典2015版总则，主要包括：
凡例：主要增加对检测方法适用性、制剂通则、辅料 标准适用性等的要求
杨凌化药质量部ＱＣ周国娟 电话：15991721352 2015.04.21
目录
一、15版药典结构； 二、非无菌产品微生物检查； 2.1微生物计数法 2.2控制菌检查法 2.3微生物限度标准 三、微生物实验室质量控制内容； 3.1实验菌株的质量控制 3.2培养基的质量控制实验 3.3微生物鉴定技术 四、制药用水的检验及修订内容； 五、药品微生物实验室规范指导原则增修订的内容
2.1微生物计数法
定义：系指对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和 真菌的计数，不适用于活菌制剂的检查。本法 适用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准。
2015版 1105非无菌产品微生物限度检查--微生物计数 法
2.1微生物计数法
1、试验环境
操
2、供试液制备
作
流
3、培养基配制
1、根据供试品的理化特性与生物学特性，来制备供 试液。常用的制备方法详见“通则1105非无菌产 品微生物限度检查--微生物计数法”中规定。其 中不同于10版药典就是缓冲液、某些样品量的规 定有所变化；
2、供试液的浓度，按照方法确认的结论进行确定；
3、供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不 应超过45℃；
程
4、试验方法选择
5、培养计数及结果报告
2.1微生物计数法—试验环境
项目
检测 环境
《中国药典》2015年版微生物培训
4.按制备方法分类
（1）商品化即用型配培养基 以即用形式或融化后即用形式置于容器（例如平皿、试管或其他容器）
内供应的液体、固体或半固体培养基： ——完全可即用的培养基 ——需重新融化后的培养基（如用于平板倾注技术） ——使用前需重新融化并分装（如倾注到平皿）的培养基 ——使用前需重新融化，添加物质并分装的培养基
（3）液体培养基：固体培养基的对应词，是微生物或动植 物细胞的液状培养基。它具有通气培养、震荡培养的优点。 在静止的条件下，在菌体或培养细胞的周围，形成透过养 分的壁障，养分的摄入受到阻碍。由于在通气或在振荡的 条件下，可消除这种阻碍以及增加供氧量，所以有利于细 胞生长，提高生产量。
3.按用途分类
在特定条件下培养基对测试菌株的反应。
培养基的定义和分类
培养基的分类依据
1.按组成成分分类 2.按状态分类 3.按用途分类 4.按制备方法分类
1.按组成成分分类
（1）纯化学培养基：有已知分子结构的纯度的化学成分配 制而成的培养基。
（2）未定义和部分定义的化学培养基：全部或部分由天然 物质、加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基。
（1）运输培养基：在取样后和实验室处理前保护和维持微 生物活性且不允许明显增值的培养基。运输培养基中通常 不允许包含使微生物增值的的物质，但是培养基应能保护 保护菌株。（例如：缓冲甘油-氯化钠溶液）
（2）保藏培养基：由于在一定期限内保护和维持微生物活 力，防止长期保存对其的不利影响，或使其在长期保存后 容易复苏的培养基。（例如：营养琼脂斜面）
02Part One 药品微生物的检验与控制
药品微生物（Pharmaceutical Microbiology）
药品环境对微生物的影响 消毒与灭菌 无菌保障技术 微生物监控 微生物检验
中国药典2015版-微生物限度检查解析
菌种的传代、保藏与管理
控制程序
菌种来源
菌种的保 管
菌种的复 活
菌种确认
菌种的储 存和领用
菌种的销 毁及领用 记录
菌种传代、保存、使用及销售记录
菌种名称： 传 代 日 期 菌 种 来 源 菌种编号： 传 代 支 数 菌 种 生 长 培 养 基 培 养 温 度 时 间 保 存 温 度 保管人： 发 出 日 期 发 出 方 式 日期： 购 买 单 位
《中国药典》2015年版-微生物限度 标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合 并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物 限度标准。
标准修订内容
参考欧美日药典标准 <1>修订菌数标准表达方式： 指数形式10ncfu，最大可接受限度值遵守2倍规则： 101cfu： 可接受的最大菌数为 20； 102cfu： 可接受的最大菌数为 200； 103cfu： 可接受的最大菌数为 2000：依此类推。 <2>检查指标： 需氧菌总数：TAMC（替代细菌数）----胰酪大豆胨琼脂培养基 耐胆盐的格兰阴性菌（替代大肠菌群） <3>检查制剂分类： 齿龈、皮肤制剂 原辅料、中药提取物、中药饮片的控制 呼吸道制剂耐胆盐格兰阴性菌的控制
增加新概念
• • • • • 1.MPN法使用范围：含菌量较低的供试品细菌总数测定 2.“分散均匀”：并非一定要溶解 3.偏差调查概念引入 当检验结果出现超常或超标时需要进行偏差调查 调查范围：人、机、料、法、环
控制菌检查法修订解析
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法---新增内 容
2015版《中国药典》微生物限度检查法计数法修订解析
三、通用要求
（5）菌种及菌液的制备 各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切
实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。 注意事项： 1）使用前确认菌种身份 2）根据生产商说明书复苏菌种 3）使用接种技术，不要重复从菌种包装瓶中移取菌
种或重新冷冻菌种。 4）传代代数（每接种一次即为一代） 5）菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；
若保存在2～8 ℃，可在24小时内使用。
三、通用要求
7、试验菌 修订前
修订后
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草 金黄色葡萄球菌、枯草
芽孢杆菌、白色念珠菌、 芽孢杆菌、白色念珠菌、
黑曲霉
黑曲霉
三、通用要求
8、培养基
修订前
（1）细菌计数：营养琼脂 （2）霉菌和酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂 （3）酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼 脂 （4）菌液稀释液：0.9%氯化钠溶液
2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与四环 素
接种方法
涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于SDA平板表面；
倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿，倾注该培养 基，轻轻摇匀。
适用性检查 白色念珠菌、黑曲霉于20～25 ℃培养不大于5天
与标准培养基比较，恢复率在50% ～200%之间。
接种试验用菌株后， 30～35 ℃ 培养不超过72小时，与对照培
养基比较，试验菌应生长良好。（建议：培养基呈混浊的液体， 或划线于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落）
备注：该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时，需要考虑同时满足计数 和控制菌检查培养基适用性检查控制要求。
四、培养基适用性检查
培养基名称 无菌性检查
2015年版药典微生物修订内容
科
增订了原敷料、中药提取物及饮片的微生物限
度标准。
兴
修订内容
依
1 、菌数计数结果以10n表示；
科
2、 以需氧菌总数取代细菌数。以耐胆盐革 兰
阴性菌取代大肠菌群。
依科制药
分类及其标准
1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌
新 依
的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定 2、 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定
新
依
科
2015版药典微生物修订内容
兴
依 科
一综合车间（二车间）
2015.10
依科制药
微生物计数法主要内容
新 2010版
依
科
细菌数—
兴 营养琼脂培养基
依
科
霉菌和酵母菌数 — 玫瑰红钠琼脂培养基
2015版
1、 细菌数修订为 需氧菌总数。 2、 霉菌和酵母菌数修订为 霉菌和酵母菌总数。 3、 需氧菌总数： 是指胰酪大豆胨琼脂培养基 上生长的 总菌落数(包括真菌菌落 数） 。 4、 霉菌和酵母菌总数： 是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数(包括细菌菌落数) 。 若为因 沙 氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母 菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含 有抗生素的（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄 琼脂培养基或其它选择性培养基（如玫瑰红钠琼 脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
依
霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（ SDA）
科
依科制药
新 修订后
依
耐胆盐的革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、
科
铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色
念珠菌
兴
修订前
2015版药典微生物相关知识
2015年版微生物检查培训微生物检验包含微生物限度检查和控制菌检查微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求,检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定，所选的方法适用性须经确认。
供试品检查：1.供试液的制备：稀释剂为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，取10g供试品稀释成1:10 1:100的供试液。
2.微生物限度检查：计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
①平皿法又包括倾注法和涂布法。
每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
需氧菌总数：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）在30～35℃培养3～5天；霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）在20～25℃培养5～7天，观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数,计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数。
若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
菌数报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级,作为菌数报告的依据.取最高的平均菌落数计算1g,1ml或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。
如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
②薄膜过滤法：取相当于1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于TSA或SDA上培养。
培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
2015.11 药品微生物技术(2015版药典解读)
2015-5-13
2015版药典-微生物限度
非无菌产品微生物计数法
1.培养基的改变
营养琼脂变成TSA，把玫瑰红钠变成SDA。 2. 增加了MPN法 MPN法其实准确性是比较差的，而且这个方 法不能做霉菌和酵母菌，所以一般在药品的 微生物计数中，很少有采用此法，食品中比 较常用。
2015-5-13
CP/EP/USP 无菌检查
阳性对照 CP：需要 EP:没有要求 USP没有要求
2015-5-13
CP/EP/USP 无菌检查
总结 培养基一致； 方法一致（薄膜过滤法和直接接种法）； 培养时间一致（细微差别，存在解读问题）； 阳性对照是CP特有的。
2015-5-13
Q&A
2015-5-13
药品微生物技术
2015-5-13
2015版药典-标准的改变
微生物限度标准
2015-5-13
2015版药典-标准的改变
微生物限度标准: 现状
2015-5-13
2015版药典-标准的改变
我们要做什么？ 1、回顾产品的质量是否能符合新标准的要求： 一般都能符合的，但是如果不符合，要改的就 不光是检验这边的东西，从生产体系开始改。 2、修订标准： 标准修订完以后，微生物实验室的洁净环境 、人员的无菌操作技术和意识一定要跟上来， 为什么？ 因为一般产品都是需要10倍稀释，如果在检 验过程中污染的话，一个两个就到达20的标准 了。
பைடு நூலகம்
2015-5-13
2015版药典-微生物限度
非无菌产品微生物计数法-抑菌性消除： 2010版： 2015版：
2015-5-13
2015版药典-微生物限度
2015版中国药典微生物检验
非无菌药品微生物限度标准 (通则1107)解析
• 修订思路
（1）将《中国药典》2010版一、 二、三部微生物限度标准项目进行对比、整合。 • 采用一部的限度标准项目作为合并后限度标准的 基础。 • 参考EP7.0、USP35、JPⅩⅤ标准，修订中国 药典的微生物限度标准。 • 采用清晰直观的表格形式，按给药途径、分液 体、固体性状、列出各类药品的限度标准。
检验量
• 一般随机抽取不少于2个最小包装的供试品 ，混合，取规定量供试品进行检验。 • 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm2；贵重或微量包装 药品的检验量可以酌减。 • 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取 供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不 得少于4片。
微生物基本知识
• 定义：微生物（microorganism）是对所有 形体微小，单细胞或结构较为简单的多细 胞甚至无细胞结构的低等生物的统称。
微生物的分类
• 原核微生物：细菌、放线菌、立克次氏体 支原体、衣原体、蓝细菌和古细菌
• 真核微生物：酵母菌、霉菌、粘菌、原生 动物和藻类 • 非细胞型生物：病毒、噬菌体、类病毒、 拟病毒和朊病毒
试剂和试药
• 中和剂、灭活剂和表面活性剂均应对微生物无 毒性其相互间具有相容性，有利于样品中微生 物均匀分散。 • 稀释液 1、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；2、pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2无菌磷酸盐缓冲液 、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要，可在上 述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中 和剂等。3、0.9%无菌氯化钠溶液。
格式变化
中国药典2010年版微生物计数法编排方式
中国药典2015年版微生物计数法编排方式
内容变化
《中国药典》2015年版微生物基本知识
(3)沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
《中国药典》2015年版微生物培训2
色念珠菌、黑曲霉
色念珠菌、黑曲霉
通用要求变化——菌种及菌液制备
9203：药品微生物实验室质量管理知道原则——菌种
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机 构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的 商业派生菌株。
标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或 按已验证的方法进行。
9203：药品微生物实验室质量管理指导原则——
“微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进 行”。
9205：药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则——
用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的 检测和控制。
通用要求变化——试剂和试药
试剂和试药
中和剂、灭火剂和表面活性剂均应对微生物无毒性， 其相互间具有相容性，有利于样品中微生物的分散。
适用性检查：白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培养不超过5天。 与对照培养基比较，比值在0.5-2范围内，且菌落大小、形态一 判断标准 致。
阴性对照：20-25℃培养5天无菌落生长。
培养基适用性检查—示例
名称
沙氏葡萄糖琼脂+抗生素 （当细菌超标引起需氧菌总数超标时用）
阴性对照及培养基适用性检查同沙氏葡萄糖琼脂，增加抑菌性检查试验。
稀释液
1.PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液；
2.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液、PH7.2无菌磷酸盐缓冲液、 PH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要可在上述稀释液灭菌前 加入表面活性剂或中和剂等。
3.0.9%无菌氯化钠溶液。
通用要求变化——培养基
对照培养基 按标准物质管理，由中检院负责研制分 发。
培养基适用性试验 2皿（0.5～2.0），2管（生长良 好）。
2015年药典微生物检
2015年药典微生物检在检测环境中生长，或者生长相对缓慢，在设定时间内不能形成可见菌落。
1、细菌存活但不能被检出2、陪演技的选择性3、培养方法的固有缺陷4、细菌的亚致死受损与再生长提高一样菌计数结果的途径：1、直接计数法1.1扫描电镜观察计数法1.2荧光显微镜观察计数2、改进接种方法2.1均匀涂布接种2.2薄膜过滤法2.3调整培养温度和时间（生物制品两种温度培养）2.4选用替代培养基所用培养基及其成分：由于R2A培养基能促进受损细菌的恢复性再生长，其在20℃下培养7d或得的最高菌落数总是高于营养琼脂和m-SPC，R2A均匀涂布计数结果更高细菌在R2A培养基上的生长速度要慢，形成的菌落要小，在48h内，准确计数困难，因而需要延长培养时间，使菌落生长的足够大，但不会或少融合生长。
有利于刺激受损细菌和对氯有耐药性细菌的生长。
纯化水【检查】微生物限度取本品不少于1ml，按薄膜过滤法处理后，采用R2A琼脂培养基，30-35℃培养不少于5天，依法检查（通则1105），每1ml供食品中需氧菌总数不得过100cfu。
R2A轻质培养基适用性检查试验按照通则1105中“计数培养基适用性检查”的胰酪大豆胨琼脂培养基的适用性检查方法进行，试验菌株为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。
应符合规定。
注射用水【检查】微生物限度取本品不少于100ml，按薄膜过滤法处理后，采用R2A琼脂培养基，30-35摄氏度培养不少于5天，依法检查（通则1105），每100ml供试品中需氧菌总数不得过10cfu。
2015年版药典的纯化水、注射用水[微生物限度]检查方法在参考欧、美药典制药用水微生物检查要求的基础上，由浙江所立课题考察、比对，在所用培养基和方法上将有较大的修订。
不同药典关于纯化水的微生物检测方法和质量标准修订原因：营养琼脂等培养基可能只检出了水样细菌总数中很少的一部分，其他未检出的细菌根本就不能在检测环境中生长，或者生长相对缓慢，在设定时间内不能形成可见菌落。
2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
2015版微生物检验有关变化情况解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
微生物检查法-《中国药典》2015年版 第三部 w
1101无菌检查法照品溶液，用前配制。
测定法精密量取供试品0.3ml置试管内，依次加6%乙酸钠溶液1.3ml、1%对氨基苯磺酸溶液0.2ml及1.3%碘液0.1ml，混匀，放置10分钟，加0.4mol/L硫代硫酸钠溶液50M1，混匀脱色，加0.6%a-萘胺溶液40^1，混匀，室温放置60分钟，经每分钟10 000转离心5分钟后，取上清液，照紫外-可见分光光度法C通则0401),在波长520n m处测定吸光度。
精密量取不同浓度的对照品溶液各0.3tnl，置试管中，自“依次加6%乙酸钠溶液中国药典2015年版1.3ml”起，同法操作。
精密量取水0.3ml置试管中，自“加6%乙酸钠溶液1.3ml”起，同法操作，作为空白对照。
以对照品溶液的羟胺浓度对相应吸光度作直线回归，求得直线回归方程；将测得的供试品的吸光度代人直线回归方程，即得供试品的残留羟胺浓度（nmol/ml)，再根据供试品的蛋白质含量按下式计算出羟胺残留量（nmol/mg 蛋白质）。
•供试品羟胺残留量—供试品的残留羟胺浓度（nmol/ml) (nmol/mg蛋白质）供试品的蛋白质含量（mg/ml)微生物检查法1101无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气E、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。
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试验菌
2010版
大肠埃希菌
2015版
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌、黑曲霉 白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。 (2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。 (3)沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。
2010版
(1)PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 (2)PH7.2无菌磷酸盐缓冲液 (3)PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠 溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液 （用于结肠溶制剂）
2015版
(1)PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 (2)PH7.2无菌磷酸盐缓冲液 (3)PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠 溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓 冲液（用于结肠溶制剂） (4)增加胰酪胨大豆肉汤培养基 ●不局限上述稀释液
2010版
试 验 菌 株 1、营养琼脂：大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 杆菌 2、玫瑰红钠琼脂：白色念 珠菌 黑曲霉
2015版
1、胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠 菌、黑曲霉 2、胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 3、沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲 霉
培养基适用性检查
培养基名称 沙氏葡萄糖琼脂+抗生素 （当细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用） 无菌性检查 取已灭菌的SDA注皿，用于20~25℃培养5~7天，应无菌落生长。 抑菌性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 试验用菌种 促生长能力：白色念珠菌、黑曲霉 1、庆大霉素：广谱。对G-，G+菌有比较好的抗菌作用 常用抗生素 2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与 四环素。 接种方法 抑菌性：接种不小于100cfu试验用菌。 促生长能力：接种不大于100cfu试验用菌。
简便、严谨
评价
微生物检测环境变化
2010版
检测环境 应在洁净度10000级背景 下的局部100级单向流空 气区域内进行
2015版
应在受控洁净环境（不低于 D级洁净环境）下的局部洁 净度不低于B级单向流空气 区域内进行
·其他要求：
▷ 检验过程及环境既要最大可能防止样品受污染，又要防止检验过程 对环境和人员造成的危害。 ▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
培养基适用性检查
2010版
检查范围
加菌量
2015版
微生物计数用的成品培养基、由脱水培 养基或按处方配制的固体和液体培养基
固体培养基
50~100CFU
不大于100CFU
培养温度 营养琼脂：30~35℃ 胰酪大豆胨琼脂TSA：30~35℃培养 玫瑰红钠：23~28℃ 胰酪大豆胨肉汤TSB： 30~35℃培养
白色念珠菌、黑曲霉于20~25℃培养不大于5天。与对照培养基 适用性检查 比较，恢复率在50%~200%之间。 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌应不得生长。
计数方法适用性试验
1、常用的供试液制备方法 (1)水溶性供试品 (2)水不溶性非油脂类供试品 (3)油脂类供试品 (4)需要特殊方法制备供试液的供试品：①膜剂、②肠溶及结肠溶制剂、③ 气雾剂喷雾剂、④贴剂。
2、接种和稀释
2010版
试验组 供试液和菌液同时 加入平皿中
2015版
供试液，加入试验菌液，混匀，使 每张滤膜所滤过的供试液中含菌量 不大于100cfu。
供试品 对照组
菌液对 照组 中和剂 对照组
供试液直接加入平 皿中
直接加入菌液到平 皿中 稀释剂对照组
稀释也代替菌液同试验组操作。 （中国药典特殊规定的，协调案无 相关要求）
微生物计数用培养基
2010版
1、营养琼脂用于细菌计数 2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数 3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数 4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
2015版
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定 2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定 3、沙氏葡萄糖琼脂+抗生素用于细菌超标引起 霉菌和酵母菌总数超标用 4、菌液制备用培养基：PH7.0无菌氯化钠-蛋白 胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液
微生物检查体系的调整
2010版
分类依据 质控分类 检验体系 项目1 按微生物类别分 细菌、真菌 选择培养、或者人为区分 细菌数 营养琼脂
2015版
按营养条件分 需气、厌气菌 直接与培养条件对应 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂 （TSA）
项目2
霉菌及酵母菌总数 玫瑰红钠琼脂
容易造成漏检
霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂 （SDA)
沙氏葡萄糖琼脂SDA：20~25℃培养
培养时间 可接受标 准
细菌：48h 真菌：72h
细菌不超过72h，真菌不超过5天
固体培养基（与对照培养基）： 50%~200%（0.5~2） 液体培养基（与对照培养基管比较）： 生长良好
建议：培养基呈混浊的液体，或划线于相应的 分离平板上，培养后呈现典型菌落
70%
控制菌项目变化
培养基体系 2010版
大肠菌群大肠埃希菌 Nhomakorabea2015版
耐胆盐革兰阴性菌
大肠埃希菌 沙门菌
明显变化
沙门菌
铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌
铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
无明显变化
白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
通用要求要点： (1) 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 本 检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法 等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指 导原则 (2) 环境洁净度应符合要求。定期检测：不低于B级的单向流空气区域、工作 台面、环境。参考USP〈1117〉实验室分区原则。 (3) 前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面 活性剂的无毒性及与相容性。 (4) 方法选择：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。（平皿 法、薄膜过滤法和MPN法） (5) 菌种管理：（9203）药品微生物实验室质量管理指导原则关于菌株管理 的要求。 (6) 阴性对照：微生物检查需进行阴性对照试验。如果对照有菌生长，应进 行偏差调查。