电镜样品基本制备方法第二节负染色技术
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电镜样品的基本制备方法
第二节 负染色技术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度 的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如 磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在 黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结 构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄 切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制， 目前还不够清楚。
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
—、负染样品的制备
负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这 种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这 样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。 操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的 铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部 制备过程分述于下。
（三）离心提纯法
用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀 浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离 心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎 片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温 超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。
二、染液的配制
一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸 （PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、 醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷 钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5 ％～3％的溶液，染色前应用：
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把 带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾 取样品；然后，用滤纸吸干铜网上的多余悬液， 再将铜网在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最 后再用滤纸将染液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的悬液将 要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬 液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色 效果，便得不到理想的负染电镜图像。
（四）样品的均匀分散性 在进行负染时，经 常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂 与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清 样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是 悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现 象。
三、负染色操作方法
（—）滴染法
将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸取，滴 于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度, 立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多 余液体，即可滴上染液，染色时间1～2分钟．而 后即可用滤纸吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液滴离开 吸管后自然滴下，否则液滴易将铜网吸起；（2） 支持膜应完好无损，吸管不能太粗，液滴不能太 大，否则都不能形成良好的液珠；（3）病毒在液 滴的边缘分布较多，操作时不宜用滤纸吸干，而 任其自然稍干后再加染液。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学 研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不 需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作， 而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与 超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药 量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用 于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离 的细胞器等研究工作。
（—）浓缩取样法
适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。
１．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒和副粘 液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等 量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞 表面；
而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附 有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清 液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放 3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的 溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处 理。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到6.4－ 7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH为4.5～5.5， 染液在用前新鲜配制，盐溶解需20～30分钟。钼 酸铵配制成2～3％溶液，使用时用醋酸铵将pH调 至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子散射能 力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射下不升 华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样品不发 生化学反应，易在不规则样品表面渗透。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所培养的 腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁上清液，于沉 淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1： 4），Baidu Nhomakorabea细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速 冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上 清液滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒如鼻病 毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝 炎抗原等，可于相应的抗体形成病毒一抗体复合 物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴 膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广 泛用于病毒疾病的快速诊断。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更 为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效 果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的 酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到 病毒的结构。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及 疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再 将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍 干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊 断．
对于生长在固体培养基上的微生物，可用白 金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可 滴样，待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上 的噬菌体斑，也可采用直接取样法。
第二节 负染色技术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度 的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如 磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在 黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结 构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄 切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制， 目前还不够清楚。
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
—、负染样品的制备
负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这 种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这 样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。 操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的 铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部 制备过程分述于下。
（三）离心提纯法
用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀 浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离 心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎 片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温 超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。
二、染液的配制
一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸 （PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、 醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷 钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5 ％～3％的溶液，染色前应用：
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把 带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾 取样品；然后，用滤纸吸干铜网上的多余悬液， 再将铜网在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最 后再用滤纸将染液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的悬液将 要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬 液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色 效果，便得不到理想的负染电镜图像。
（四）样品的均匀分散性 在进行负染时，经 常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂 与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清 样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是 悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现 象。
三、负染色操作方法
（—）滴染法
将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸取，滴 于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度, 立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多 余液体，即可滴上染液，染色时间1～2分钟．而 后即可用滤纸吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液滴离开 吸管后自然滴下，否则液滴易将铜网吸起；（2） 支持膜应完好无损，吸管不能太粗，液滴不能太 大，否则都不能形成良好的液珠；（3）病毒在液 滴的边缘分布较多，操作时不宜用滤纸吸干，而 任其自然稍干后再加染液。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学 研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不 需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作， 而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与 超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药 量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用 于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离 的细胞器等研究工作。
（—）浓缩取样法
适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。
１．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒和副粘 液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等 量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞 表面；
而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附 有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清 液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放 3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的 溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处 理。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到6.4－ 7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH为4.5～5.5， 染液在用前新鲜配制，盐溶解需20～30分钟。钼 酸铵配制成2～3％溶液，使用时用醋酸铵将pH调 至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子散射能 力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射下不升 华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样品不发 生化学反应，易在不规则样品表面渗透。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所培养的 腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁上清液，于沉 淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1： 4），Baidu Nhomakorabea细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速 冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上 清液滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒如鼻病 毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝 炎抗原等，可于相应的抗体形成病毒一抗体复合 物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴 膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广 泛用于病毒疾病的快速诊断。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更 为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效 果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的 酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到 病毒的结构。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及 疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再 将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍 干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊 断．
对于生长在固体培养基上的微生物，可用白 金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可 滴样，待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上 的噬菌体斑，也可采用直接取样法。