电镜样品基本制备方法第二节负染色技术
负染色操作步骤-概述说明以及解释
负染色操作步骤-概述说明以及解释1. 引言概述部分的内容可以按如下方式编写：1.1 概述负染色是一种常用的细胞和组织样品处理技术，它常被应用于生物学和医学研究中，用于观察细胞和组织内部的结构和特征。
相比于传统的正染色方法，负染色操作具有一些独特的优势和特点。
在负染色过程中，样本被浸泡在一种特定的染料溶液中，这种染料溶液往往是一种与样品的成分不相溶的物质。
负染色的关键在于利用染料的物理和化学性质，使其与样品发生作用，从而使样品的细节和特征得以显示。
负染色的操作步骤相对简单，但需要一定的技巧和经验。
本文将详细介绍负染色的操作步骤要点，旨在帮助读者快速掌握负染色技术并正确应用于实验中。
负染色的具体步骤将在接下来的章节中进行介绍，主要包括：样品制备、染料选择、染色操作、观察和分析等环节。
通过正确的操作步骤，可以获得清晰、可靠的负染色结果，从而进一步推进相关研究领域的发展。
总之，负染色作为一种常用的细胞和组织样品处理技术，具有独特的优势和特点。
本文将深入介绍负染色的操作步骤要点，希望能够为读者提供一份实用的参考，帮助其在实验中正确应用负染色技术。
文章结构部分的内容应该是关于整篇文章的组织结构和章节安排的介绍。
可以按照以下方式编写：文章结构：本文将按照以下结构进行叙述：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 负染色操作步骤要点12.2 负染色操作步骤要点23. 结论3.1 总结3.2 展望在引言部分，我们将简要说明本文的主题和目的，以及为什么负染色操作步骤的了解对于某些特定应用领域的重要性。
接下来的正文部分将分为两个要点，分别介绍负染色操作的具体步骤，包括所需材料、实验条件等重要信息。
通过对每个步骤要点的详细描述，读者将能够理解负染色操作的基本原理和实施方法。
最后，在结论部分，我们将对整篇文章进行总结，回顾负染色操作的关键步骤和要点，并展望未来在该领域的进一步研究和应用方向。
通过以上的文章结构安排，读者将能够清晰地了解整篇文章的内容组织和章节间的逻辑关系，从而更好地理解和掌握负染色操作步骤的相关知识。
负染色技术
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷鸭酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的”空洞”被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质（如重金属盐等）”包埋”低电子密度的样品，结果在图像中背景是照暗的，而样品像”透明”地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高（可达15A）,简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、人小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
［编辑］负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易滲入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钩酸、磷钩酸钾和磷餌酸钠（分别简称为PTA、KPT、NaPT）o此外醋酸铀、甲酸铀、硅鹄酸、铝酸钱等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钩酸、磷鹄酸钠、磷钩酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1%〜3%的溶液，使用时应用1 mol / L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4〜7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2%〜0.5%水溶液（pH4.5）o醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15〜30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1 mol / L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
甲酸铀：用双蒸水配制成0.5%〜1%水溶液，pH值为3.5,使用时用lmol/L的氢氧化钠溶液将pH 值调至4.5〜5.2。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
负染色技术1
异常反差原理： 异常反差原理：
用PTA 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂晶体发生 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂 了异常反差。在电镜下观察时发现， 了异常反差。在电镜下观察时发现，在同一视野内凡 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 是被 PTA 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 的晶体， 染色的氧化鎂 的晶体，未被 PTA 染色的氧化鎂晶体则呈现不透明 暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA PTA在电 的（暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA在电 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场， 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场，它 起到一个“静电小透镜”的作用， 起到一个“静电小透镜”的作用，把电子聚焦于样品 使样品中的电流密度得到加强， 上，使样品中的电流密度得到加强，结果样品图象的 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。
(五).注意的问题 五 注意的问题
1).悬液样品的纯度 悬液样品的纯度 2).悬液样品的浓度 悬液样品的浓度 3).样品和染液的均匀分布问题 样品和染液的均匀分布问题 • 使用分散剂 • 亲水性处理 4).样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度问题 5).染色的时机 染色的时机
负染色剂及其适用的PH范围
负染色剂 磷钨酸钾 醋酸铀 甲酸铀 钼酸铵 钨酸锂 硼酸钨钠 浓度 % 2 0.1~1 0.5~1 2.0~3 2 2 PH范围 PH范围 6.0—7.0 4.0—5.2 4.0—5.2 7.0—7.4 6.0—7.5 5.5—7.0 醋酸氨 醋酸氨
样品缓冲液
醋酸氨
•
负染色可观察样品的范围：um~nm 负染色可观察样品的范围 球状 7 nm 链状 直径 2 nm
电镜技术-第7次课
稀释，悬浮病毒的缓冲液应尽可能稀一些。较浓的缓 冲液会使载网上产生许多盐类的结晶而影响图象的质 量。缓冲液较浓时，宜先用双蒸水稀释。
3.负染用的载网支持膜(尤其是碳膜)，有时
因疏水性的影响沾样后会形成一个球形液珠，用 滤纸一吸即全部吸光，样品难以附着在支持膜上。 遇到这种情况，先用离子溅射仪对载网进行亲水 处理，改善支持膜的亲水性。
2.细菌培养物
可用白金丝接菌环在斜面培养基上刮取少许菌苔 于双蒸水中配成悬液。若观察鞭毛，须用不超过24 小时培养的新菌落，直接在培养物中加入双蒸水， 细菌自动游动悬浮起来便可进行负染观察。
3.动物病毒组织培养物
应进行浓缩以增加病毒的检出率。例如，大多数 粘液病毒和副粘液病毒可用红血球吸附法浓缩，方 法是将病毒培养物与红血球等量混合，静止5分钟， 使病毒吸附于红血球表面，然后以80Orpm离心15分 钟，沉淀用生理盐水悬浮，在冰箱中放3~4小时，病 毒即从红血球表面释放到上部溶液用。所用双蒸水 和生理盐水均需灭菌。
5.硅钨酸
性能类似于磷钨酸，在中性偏碱性情况下使用可 以更好地显示出病毒颗粒的细微结构，一般配成1~2% 的水溶液。
负染色液PH值对染色效果的影响
负染色液的PH值对负染效果有较大的影响，一般偏 酸的染液能获得较好的染色效果，越是偏碱效果越差， 碱性染液往往造成生物标本的凝聚变形。
通常磷钨酸盐的PH值在6.0~7.0，比较容易获得较 好的效果。磷钨酸及其盐类的水溶液一般是偏酸的，常 用lN的NgOH将pH值调到6.0~7.0。醋酸铀和甲酸铀的PH 值在4.0~5.2较好，常用氨水和盐酸来调节pH值。
3.甲酸铀
特别适合于具螺旋对称的病毒颗粒，能显示出病 毒的蛋白质亚基结构。一般配成0.5~1%的水溶液，甲 酸铀极不稳定，只能临用前配制，不宜保存。
2、电子显微镜负染色技术在病毒研究中的应用
负染色在病毒研究中的应用负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
早在1892年Dmitri Iranovski就发现烟草花叶病病原的可过滤性之后，病毒就逐渐被人类认识。
然而，在此后几乎半个世纪里，人类只是把它看成为一种过滤性的致病因子，对它的认识是非常含糊的。
因为病毒太小了，即使应用了高性能的光学显微镜，人们也无法直接观察到，只能通过间接的方法来确认它的存在。
1939年，G.A.Kansche首先用电子显微镜观察到烟草花叶病病毒（TMV）。
这是人类第一次直接观察到病毒，也是电子显微镜在生命科学最早的重要成果之一。
由于电子显微镜的应用，尤其是其后出现的电子显微镜负染色技术和超薄切片技术，使人类对病毒的认识获得了飞跃的发展。
从此开创了病毒学研究的新时代。
透射电子显微镜(2)
透射电子显微镜(2)
三、取材要领 快 尽量保持其生活状态，在1分钟内固定 小 1mm³的小块 轻 不要牵拉、锯、挤压组织 冷 4℃保存
四、超薄切片程序 取材→固定→脱水→浸透→包埋→切片→染色
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透射电子显微镜(2)
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
目前，对其染色原理还不十分清楚，有密度反差原
P理PT文档演和模板 异常反差原理二种观点。
透射电子显微镜(2)
（二） 负染样品的制备
1.染色液 目前最常用的为磷钨酸（Phosohotungstate ） 配制成2-4%磷钨酸水溶液 磷钨酸的密度约为4，而生物标本的密度为1 外周染料密度与标本密度相差4倍 直径很小的物体可被清晰地显现出来
＆电子束在真空中运动的速度与加速电压有关（ 阳极）加速电压越高，电子束的波长越短(根据光学
阿贝公式原理，一台仪器的成像最高分辨率，约为它使用 信息传递媒介波长的一半。电镜之所以能获得很高的成像 分辨率，是由于它的电子束波长远较可见光的波长为短）
＆ 电磁透镜的焦距与磁场（线圈组成，当电流通过 时产生磁场）强度有关,磁场越强，焦距越短，放大 倍率越高
负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生 物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研 究工作
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透射电子显微镜(2)
（一）负染技术的原理
当把有些重金属的盐溶液与生物材料的悬浮液 混合以后，重金属的盐类不是被样品成分所吸收， 而是沉淀到样品四周
如果样品具有高低不平表面结构，染液还能穿 透进表面的凹陷部分。这样在重金属元素沉淀的地 方，散射电子的能力增强，因而样品四周表现为暗 区，而在有样品的地方散射电子能力弱，因而表现 为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地 衬托出来
电子显微镜的制样
⑶超薄切片技术
• 基本操作步骤：取样→固定→脱水→浸透 基本操作步骤：取样→固定→脱水→
与包埋→切片→捞片→染色→ 与包埋→切片→捞片→染色→观察
二、扫描电镜的样品制备 二、扫描电镜的样品制备
• 扫描电镜的结构特点：利用电子束作光栅 扫描电镜的结构特点：
状扫描以获取样品的形貌信息。 状扫描以获取样品的形貌信息。 • 对样品的要求：干燥并且表面能够导电。 对样品的要求：干燥并且表面能够导电。 • 在观察的过程要保持样品不变形，其关键 在观察的过程要保持样品不变形， 是样品干燥； 是样品干燥； • 干燥的方法：自然干燥、真空干燥、冷冻 干燥的方法：自然干燥、真空干燥、 干燥和临界点干燥| 其效果最好） 干燥和临界点干燥|（其效果最好）等。 • 干燥、喷镀金属层后的样品便可用与观察。 干燥、喷镀金属层后的样品便可用与观察。
电子显微镜的制样
• 一、透射电镜的样品制备 • ⑴负染技术 • 含义：与将样品本身染色来提高反差的方法相反，负染色 含义：与将样品本身染色来提高反差的方法相反， • •
技术是用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反 技术是用电子密度高， 应的物质来对样品进行染色。 应的物质来对品进行染色。 优点：简便易行，病毒、细菌、 优点：简便易行，病毒、细菌、离体细胞奇迹蛋白质和核 酸等生物大分子的形态大小和表面结构都可以采用这种制 样方法进行观察。 样方法进行观察。 操作方法:把样品和重金属染料混合后滴加支持膜上， 操作方法:把样品和重金属染料混合后滴加支持膜上，也 可将样品用贴印或喷雾的方法加到载网上后再用染料进行 染色。 染色。
谢谢观赏！
⑵投影技术
• 含义：在真空蒸发设备中将铂或铬等对电 含义：
子散射能力较强的金属原子， 子散射能力较强的金属原子，由样品的斜 上方进行喷镀，提高样品的反差。 上方进行喷镀，提高样品的反差。 • 特点：病毒、细菌鞭毛、生物大分子等微 特点：病毒、细菌鞭毛、 小颗粒的形态大小和表面结构都可以采用 这种方法进行观察。 这种方法进行观察。
透射电镜样品制备-生物技术
半薄切片定位：
目的：定位、筛选、比较研究 （0.5～2.0μm）
半薄切片染色程序： 1．捞片 2．展片干燥 3．染色（甲苯胺蓝） 4．水洗、(透明、封固)
（2）超薄切片：
超薄切片机
厚度的辨认：
体视学显微镜下观察干涉色
暗灰色：＜400Å
灰 色：400～500Å
银 色：500～700Å
金 色：700～900Å
（2）锇酸（又称四氧化锇。OSO4, ）
1） 1%锇酸固定液的配制：（见书） 2）固定原理及优缺点
a、经典的固定剂。对蛋白质和脂质亲和力强。 b、有强烈的电子染色作用。 c、渗透较慢，0.25～0.5mm/h左右。常用作后固定。 d、对糖类和核酸保存很差，不保存酶活性。 e、固定时间不宜超过2小时。 f、提前配置，应低温、密封、避光保存。
② 包埋与固化： 组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中 固 化 。 37℃ 、 12 小 时 后 ， 移 入 45℃ ， 24 小 时 ， 60℃，24小时。
（4）包埋操作中的注意事项：
调整a液、b液的比例。
a. 器材和试剂均应注意防潮。（干燥器、烤箱） b. 配制包埋液时，防止气泡产生。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点
a、戊二醛对于蛋白质、多糖、核酸以及细胞内微管、滑面内质 网、纺缍丝、胞饮小泡和细胞基质固定良好。 b、穿透力强，可达4mm/h，常用作前固定。 c、固定后可在4℃冰箱长时间保存（数周～数月）。 d、对酶的活性保存较好，适用于电镜细胞化学研究。 e、对脂肪不起固定作用。 f、无“电子染色”作用。 g、不稳定、易氧化。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
透射电镜样本的制备
负染染色方法
悬滴法：悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴 在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上 来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟，然后用滤纸 从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色 1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜 网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜 观察。
负染
简单快速 可显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶 体等样品的形态、结构、大小及表面结构的特征。 病毒
负染染色剂的条件
较强的电子散射能力以产生足够的图像反差。 熔点高，在电子束的轰击下不会升华 溶解度大，不易析出沉淀。 在电镜下不呈现可观察到的结构。 分子小，容易渗入不规则表的凹陷处 与样品不起化学反应。
2-3%戊二醛固定液中 4℃，2小时或更长时间。
磷酸缓冲液漂洗
1%锇酸 磷酸缓冲液漂洗
3次，每次15min。
2h 3次，每次15min。（可4℃过夜） 15min 15min 15min 2次，每次20min
• 脱水：
50%丙酮 70%丙酮 90%丙酮 100%丙酮
• 浸透：
100%丙酮：Epon812=2:1 100%丙酮：Epon812=1:1 100%丙酮：Epon812=1:2 纯Epon812
脱水
去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备
常用脱水剂
乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为 中间溶剂进行转换。 丙酮
市售的无水丙酮含少量水分，可加入 无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。
脱水
H2O
H2O
H2O 70% 丙酮
15min
50% 丙酮
15min
第六章 负染色技术newC
生物电子显微技术
粘 液 病 毒 － － 流 感 病 毒
生物电子显微技术
SARS病毒负染色 /upload/html/2003042818412/feidian3.htm
生物电子显微技术
1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观 察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类 病毒为冠状病毒。1975年国家病毒命名委员会正式命名了冠状病毒 科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒分 为冠状病毒和环曲病毒两个属。
生物电子显微技术
染料
样品
铜 网
负染ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原理图
二、负染色的特点
1. 优点：
生物电子显微技术
⑴ 提高了样品的分辨率和反差高。
分辨率取决于染色剂颗粒的大小，颗粒直径
约D=7Å时，＝10～15Å，最高＝5～7Å。
⑵ 常用、简易、快速、不要求高纯度的样品
制备技术，且用量少
⑶ 不改变生物活性，即不因染色造成样品变
生物电子显微技术
生物电子显微技术
生物电子显微技术
番茄黑环病毒
生物电子显微技术
病毒荚膜：未处理
生物电子显微技术
病毒荚膜：负染色
生物电子显微技术
病毒荚膜：旋转投影
生物电子显微技术
病毒荚膜：金属投影
生物电子显微技术
人类腺病毒在人胚肾 细胞核内的晶格排列
生物电子显微技术
腺 病 毒 负 染 色
形。
生物电子显微技术
2. 缺点：
⑴ 负染原理不清楚，结果不稳定，规律
性、重复性差。
(操作时，因样品的种类、染色液浓
度、pH值变化常难以掌握。) ⑵ 负染色技术只能观察样品表面形貌， 内部结构看不清楚。
负染色技术
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。
此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。
醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
负染色技术的名词解释
负染色技术的名词解释负染色技术是一种在生物学和医学领域广泛使用的实验技术，它被用于观察细胞和组织内的结构和分子。
负染色的基本原理是使用有颜色的染料或金属离子来染色背景，从而使细胞或组织的结构或分子在显微镜下呈现出无色或反相的效果。
这项技术的发展可以追溯到19世纪末，当时科学家们开始利用高分辨率的光学显微镜来观察细胞的微观结构。
然而，细胞和组织通常是透明的或有颜色的，这使得它们难以观察和分析。
为了解决这个问题，负染色技术应运而生。
负染色技术的一个关键组成部分是负染剂。
常用的负染剂包括印染剂、金属离子和聚合物。
这些染剂通常具有高度亲和性，可以与细胞或组织中的某些分子结合或附着，使其显示出颜色。
通过选择适当的染剂和实验条件，可以实现准确和清晰的负染色效果。
负染色技术有许多应用。
在细胞生物学领域，它被广泛用于观察细胞的核形态、细胞器和细胞分裂过程。
通过对这些结构的负染色观察，研究人员可以深入了解细胞的功能和组成。
在医学诊断领域，负染色技术可以用于检测病原体、癌细胞和其他病态组织。
负染色还被用于研究纳米颗粒和材料科学领域的微观结构。
除了在光学显微镜下的应用，负染色技术还可以与电子显微镜和超分辨显微镜等高级显微技术结合使用。
通过使用高分辨率的显微镜，研究人员可以获取足够精细的图像，以观察细胞和组织中更微小的细节。
负染色技术虽然在科学研究中发挥着重要作用，但它也存在一些局限性和挑战。
首先，负染剂的选择非常重要，不同的染剂适用于不同的细胞和组织类型。
其次，负染色需要仔细控制实验条件，包括染色时间、染剂浓度和温度等，以获得清晰可见的结果。
此外，负染色仅提供细胞的形态信息，对于细胞内部的功能和动态过程了解有限。
尽管负染色技术还存在一些挑战，但随着科技的不断进步，它仍然是观察和研究细胞和组织结构的重要工具之一。
未来，随着新的负染剂的发展和显微技术的改进，负染色技术在生物学和医学领域的应用将会得到进一步拓展，为我们揭示更多关于生命的奥秘。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术PPT课件
对于具有生物活性的样品，负染色技 术需要在保持样品活性的前提下进行。 因此，需要在制备过程中采取适当的 措施，如使用稳定剂或保护剂，以保 持样品的生物活性。
涂膜的均匀性与稳定性
均匀性
在负染色技术中，涂膜的均匀性对电镜观察效果至关重要。涂膜应均匀覆盖样品表面， 避免出现涂层不均、颗粒等现象。为保证涂膜的均匀性，可采用旋转涂膜、多次涂覆等
浓度控制
染色液的浓度对染色效果和样品稳定性有重要影响。在负染色技术中，应精确控制染色液的浓度，以 确保染色效果最佳且不损伤样品。同时，还应根据实际情况调整染色液的浓度，以获得最佳的观察效 果。
观察条件的选择与优化
观察条件
负染色技术的观察条件包括电镜的加速电压、工作距离、物镜光圈等参数。这些参数的选择直接影响观察效果和 样品的成像质量。在观察过程中，应根据样品的性质和特点选择适当的观察条件，并进行优化调整。
应用领域与优势
应用领域
负染色技术广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域，如病毒、细菌、细胞、 蛋白质等生物大分子的结构和形态研究。
优势
负染色技术具有操作简便、分辨率高、样品制备时间短等优点，能够清晰地呈 现出样品的形态和结构，为科学研究提供重要的实验依据。
02
负染色技术的基本步骤
样品准备
选取适当的样品
细菌和微生物研究
在细菌和其他微生物的研究中，负染色技术也发挥了重要作用。通过负
染色，可以观察细菌的形态、排列和细胞壁等结构特征，有助于细菌鉴
定和分类。
03
蛋白质和核酸研究
负染色技术也可用于观察蛋白质和核酸等生物大分子的结构和形态。通
过负染色，可以观察到大分子的形状、大小和分布情况，有助于理解其
功能和作用机制。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
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（四）样品的均匀分散性 在进行负染时，经 常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂 与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清 样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是 悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现 象。
电镜样品的基本制备方法
第二节 负染色技术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度 的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如 磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在 黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结 构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄 切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制， 目前还不够清楚。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把 带滤纸吸干铜网上的多余悬液， 再将铜网在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最 后再用滤纸将染液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的悬液将 要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬 液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色 效果，便得不到理想的负染电镜图像。
（三）离心提纯法
用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀 浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离 心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎 片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温 超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。
二、染液的配制
一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸 （PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、 醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷 钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5 ％～3％的溶液，染色前应用：
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及 疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再 将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍 干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊 断．
对于生长在固体培养基上的微生物，可用白 金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可 滴样，待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上 的噬菌体斑，也可采用直接取样法。
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更 为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效 果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的 酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到 病毒的结构。
（—）浓缩取样法
适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。
１．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒和副粘 液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等 量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞 表面；
而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附 有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清 液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放 3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的 溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处 理。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学 研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不 需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作， 而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与 超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药 量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用 于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离 的细胞器等研究工作。
三、负染色操作方法
（—）滴染法
将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸取，滴 于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度, 立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多 余液体，即可滴上染液，染色时间1～2分钟．而 后即可用滤纸吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液滴离开 吸管后自然滴下，否则液滴易将铜网吸起；（2） 支持膜应完好无损，吸管不能太粗，液滴不能太 大，否则都不能形成良好的液珠；（3）病毒在液 滴的边缘分布较多，操作时不宜用滤纸吸干，而 任其自然稍干后再加染液。
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
—、负染样品的制备
负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这 种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这 样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。 操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的 铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部 制备过程分述于下。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所培养的 腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁上清液，于沉 淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1： 4），使细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速 冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上 清液滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒如鼻病 毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝 炎抗原等，可于相应的抗体形成病毒一抗体复合 物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴 膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广 泛用于病毒疾病的快速诊断。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到6.4－ 7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH为4.5～5.5， 染液在用前新鲜配制，盐溶解需20～30分钟。钼 酸铵配制成2～3％溶液，使用时用醋酸铵将pH调 至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子散射能 力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射下不升 华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样品不发 生化学反应，易在不规则样品表面渗透。