重叠PCR

重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。

引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。

2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。

3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。

4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq 酶进行PCR。进行PCR约5-10轮即可。

5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。建议可以优化退火温度，可以做个梯度PCR。

如果认为设计引物方面没有问题，那么再考虑其它条件。

关于重叠PCR：

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重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR 技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：

A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3

A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3

B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3

B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3

我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重叠PCR的步骤：

（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因

（2）回收A，B基因

（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B.

第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。

目前重叠PCR的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合成基因最基本的技术（目前应用最为广泛的）就是利用重叠PCR的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用DNA 调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的DNA中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重叠PCR技术就可以轻松完成。

overlap 能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）

有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。

另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。

如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR 方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。

( KB)

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最近由于实验需要，做了两组pcr，连接了一个启动子，一个调控子，还有一个抗性基因，三天就搞定。

三个pcr片段分别为131bp, 650bp., 927bp

如果你扩增的片段特异性好，用PCR回收试剂盒回收，方便快捷。

如果有杂带，只能切胶回收了。下面从pcr引物设计，重叠pcr两个方面说一下。

1.重叠pcr引物设计

很简单，就是和你平常的引物设计一样。两个基因的引物都设计好了后，如：A基因：5‘TTAAGACCCACTTTCACATT3’上游序列

5‘ TAGATTAGATAAAAGTAAAGTG3’ 下游序列

B基因

5‘ CATTAATTCCTAATTTTTGTTG3’ 上游序列

5‘ GATTTTTGTCGAACTATTC3’下游序列

把A基因的下游序列全加到B基因上游序列的5'端

把B基因的上游序列全加到A基因下游序列的5‘端

就万事OK了，别想着替你老板省钱，那是让你自己找罪受！

2、重叠pcr的做法

两个基因的pcr产物回收后

20ul体系，各取1ul,其它的如加酶等一切照常，但先不加两端引物。