基因芯片法和测序法检测乙肝病毒基因分型的耐药突变比较_张惠琴

中 图 分 类 号 ：R512．62
文 献 标 识 码 ：A
文章编号 ：1672-3619（2014）07-0867-04
Comparision of gene chip and sequenceon detection of HBV genotype and drug-resistant mutation
型 64 例 （53．33％ ）、B＋C 混 合 型 4 例 （3．33％ ）， 有 4 例未能分型（3．33％）。 2．2 HBV DNA P 区测序结果 依据说 明 书 ， 测 序 中 有 意 义 的 突 变 位 点 达 14 个 。 本 文 120 例 中 有 54 例 发 生 相 应 位 点 的 突 变 ，一 般 为 1 个 或 1 个 以 上 位 点 的 突 变 ，突 变 率 为 45．00％，其 中 以 rtM204I ／ V ／ S、rtL180M 和 rtA181V ／ T ／ S 突 变 居 多 （表 1），突 变序列分析见图 1、2。
2结果
2．1 两种方法 检测 HBV 基因分 型的 结 果 120 例 慢性乙型肝炎患者血清中，测序法检出 B 型、C 型 2 个基因 型 ，其 中 B 型 52 例 （43．33％）、C 型 68 例 （56．67％）；基因芯片法共检出 B 型、C 型以及 B＋C 混 合 型 3 个 基 因 型 ， 其 中 B 型 48 例 （40．00％ ）、C
ZHANG Hui-qin，FENG Ti-yu，ZHANG Zhuo-jin （Department of Clinical Laboratory， People's Hospital of Meizhou， Guangdong，Meizhou 514031，China） Abstract：Objective Tocompare the results of gene chip and DNA sequence on detection of hepatitis B virus genotype and drug resistance gene mutation． Method Gene chip and DNA sequencewere used to detect HBV genotype and drug resistance gene mutation on 120 serum samples （HBV-DNA＞1×103 IU ／ ml）． Results In 120 serum samples of patients with chronic hepatitis B， there were 52 cases of type B （43．33％）， 68 cases of type C （56．67％） detected by DNA sequence， and there were 48 cases of type B （（40．00％）， 64 cases of type C （53．33％）， 4 cases of type B＋C （3．33％）， 4 cases of undifferentiated type detected by gene chip． 54 cases of drug resistance gene mutation were detected by sequence and 58 cases by gene chip． Based on the common resistance loci ， case of mutation detected by gene chip was a little more than by DNA sequence ， but there was no statistically significant difference． Conclusion The results of HBV genotype and drug resistance gene mutationdetected by gene chip were consistent with that by sequence． Key words： HBV； gene chip；sequence；resistance gene mutation
摘要：目的 比较基因芯片法和测序法检测乙肝病毒基因分型及耐药突变基因的一致性。 方法 采用基因芯片法
和 测 序 法 对 120 例 慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 血 清 标 本 （HBV－DNA＞1×103 IU ／ ml） 进 行 检 测 ， 比 较 两 种 方 法 检 测 乙 肝 病 毒
基因分型和耐药突变基因的情况。 结果 120 例慢性乙型肝炎患者血 清中，测序法检出 B 型 52 例 （43．33％）、C 型 68
例 （56．67％）；基 因 芯 片 法 检 出 B 型 48 例 （40．00％）、C 型 64 例 （53．33％）、B＋C 混 合 型 4 例 （3．33％），有 4 例 未 能
分 型 （3．33％）； 测 序 有 54 例 发 生 耐 药 位 点 突 变 ， 突 变 率 为 45．00％； 基 因 芯 片 有 58 例 发 生 耐 药 位 点 突 变 ， 检 出 率
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热带医学杂志 2014 年 7 月第 14 卷第 7 期 J Trop Med，Jul． 2014，Vol．14，No．7
司；乙型肝炎病毒突变 P 区检测试剂盒 （DNA 测序 法） 购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。 1．3 DNA 提取 采用煮沸法提取病毒 DNA。 1．4 HBV P 区测序法检测 采用双脱氧链终止法＋ 荧光标记检测，检测步骤参考试剂盒说明书进行。 1．4．1 PCR 扩 增 与 产 物 纯 化 采 取 荧 光 聚 合 酶 链 式 反 应 扩 增 HBV P 区 序 列 ， 依 据 荧 光 反 应 曲 线 增 长情况评估扩增反应是否成功。 产物纯化：取产物 5 μl 加 入 2 μl 碱 性 磷 酸 酶 混 合 物 混 匀 ，37℃ 1 h， 80℃ 15 min。 1．4．2 测序反应与产物纯化 测序反应体系如下： PCR 酶 解 产 物 3 μl、 测 序 引 物 2 μl、 测 序 反 应 液 1 μl。 反 应 条 件 如 下 ：96℃ 预 变 性 1 min；96℃ 变 性 10 s，50℃ 退火 5 s，60℃ 延伸 4 min，25 个循环；4℃ 恒温保存。 测序产物加入醋酸钠乙醇（3 mmol ／ L 醋 酸 钠 ： 无 水 乙 醇 ＝1∶15）16 μl， 进 行 离 心 纯 化 ， 待 酒 精挥发干净， 加入 10 μl 甲 酰 胺 后 置 PCR 仪 变 性 ： 95℃ 4 min。 4℃ 4 min。 上测序仪测序。 1．4．3 测 序 结 果 分 析 所 得 序 列 图 采 用 Chromas2 软件，通过与美国国立生物技术信息中心基因库标 准序列比对，分析测序结果。 1．5 基 因 芯 片 检 测 采 用 PCR-反 向 点 杂 交 法 ，检 测操作步骤参照试剂盒说明书进行。 1．5．1 PCR 扩 增 反 应 体 系 为 ： 基 因 组 DNA 1．5 μl，PCR 反应液 23．5 μl，总体积 25 μl；扩增 液 中 含 生物素残基标记的引物对。 设置阳性对照和阴性对 照， 与标本一起扩增。 扩增 条 件 均 为 ：50℃ 5 min、 95℃ 10 min；94℃ 60 s、68℃ 90 s，30 个 循 环 ；94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 30 s，30 个循环；72℃ 5 min。 1．5．2 杂交、洗膜、显色反应 杂交在分子杂交仪 中 进 行 ，抗 体 液 为 过 氧 化 物 酶 （POD）标 记 的 链 酶 亲 和 素 ， 显 色 液 为 四 甲 基 联 苯 胺 （TMB ） 。 1．5．3 结果判读 在试验成立的条件下，根据显色 （蓝 色 斑 点 ）出 现 的 阵 列 位 点 直 接 判 读 HBV 的 基 因 型和耐药突变类型。 1．6 质量控制 实验全程设置阴阳性对照。 1．7 统 计 学 分 析 采 用 SPSS14．0 软 件 进 行 统 计 分 析 ， 组 间 比 较 采 用 χ2 检 验 ，P＜0．05 为 差 异 有 统 计学意义。
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·实 验 研 究 论 著·
基因芯片法和测序法检测乙肝病毒基因分型的 耐药突变比较
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张惠琴，冯体玉，张灼锦 （梅 州 市 人 民 医 院 检 验 科 ，广 东 梅 州 514031）
48．33％；以 共 有 的 耐 药 位 点 来 统 计 ，基 因 芯 片 法 的 变 异 检 出 数 稍 高 于 直 接 测 序 法 ，两 种 检 测 方 法 间 差 异 无 统 计 学 意
义。 结论 基因芯片法和测序法在同时进行乙肝病毒基因分型和耐药突交基因的检测中，可认为检测结果一致。
关键词：乙肝病毒；基因芯片；序列分析；耐药突变基因
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11．67
rtM204I ／ V ／ S ATG→ATT ／ GTG ／ TCT
乙 型 肝 炎 是 由 乙 型 肝 炎 病 毒 （hepatitis B virus， HBV）引 起 的 一 种 传 染 性 疾 病 ，HBV 基 因 型 分 布 呈 现 地 区 区 域 性 分 布 特 点 ， ［1－4］ 根 据 HBV 全 基 因 序 列 的同源性＞92％或者 S 基 因 序 列 同 源 性＞96％，可 将 HBV 分为 A-I 等 9 种基因型。 目前临床治 疗 应 用 最多的抗乙肝病毒药物是核苷类似物，患者长期服 用此类药物可诱导 HBV 基因区发生变异， 会降 低 病 毒 对 药 物 的 敏 感 性 。 HBV 基 因 型 和 耐 药 相 关 位 点 的 突 变 常 用 的 检 测 方 法 有 PCR 产 物 直 接 测 序 法 、实 时 荧 光 PCR 法 、焦 磷 酸 测 序 法 、 基 因 芯 片 法 和 限 制 性 片 断 长 度 多 态 性 分 析 （PCR-RFLP） 等 ， 本 实验利用基因芯片法和测序法， 检测 HBV 基因 型
表 1 测序法检测耐药基因突变位点结果 Tab．1 Results of drug-resistant gene mutation by sequence
突变位点
突变碱基序列
检出数 检出率（％）
rtL180M
CTG ／ TTG→ATG
33
27．50
rtA181V ／ T ／ S GCT→GTT ／ ACT ／ TCT
作 者 简 介 ： 张 惠 琴 （1974－ ）， 女 ， 主 管 技 师 ， 从 事 临 床 微 生 物 检 验 方 面 的 研 究 ，E-mail：chickensu＠126．com
和耐药相关位点的突变， 以评价两种方法的一致 性，现报告如下。
1 材料与方法
1．1 对 象 收 集 2012 年 6 月 至 2013 年 6 月 梅 州市人民医院门诊病人服用拉米夫定等核苷（酸）类 药 物 治 疗 1 年 以 上 ，HBV-DNA 大 于 1 ×103 IU ／ ml 的 120 例 慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 血 清 ， 其 中 男 72 例 ， 女 48 例，年龄 20～49 岁，平均年龄（33±8）岁。慢性 乙 型 肝 炎 的 诊 断 标 准 ：HBsAg 阳 性 超 过 6 个 月 ，或 有乙肝或 HBsAg 阳性史，现 HBsAg 仍为阳性者。 1．2 主 要 仪 器 和 试 剂 病 毒 DNA 提 取 试 剂 盒 、 HBV DNA 基因芯片试剂盒、 分子杂交 仪 购 自 亚 能 生 物 技 术 有 限 公 司 ；7900PCR 扩 增 仪 、7500 荧 光 定 量 PCR 仪 、ABI3130XL 测 序 仪 购 自 美 国 ABI 公