基因芯片第三章基因芯片的制作方法
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MM探针的作用： 内参 提高特异性 背景信号 提高灵敏度
芯片结果准确可靠
图3-25 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较
图3-27 Affymetrix芯片的重复性实验（信号值的散点图）
4. 光导原位合成法的缺点
1. 需要避光掩膜，造价高； 2. 光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的
阵列密度 低 高
所需探针量 高 低
检测方法 放射性 多种
标记 单色 彩色
2. 探针分子与基片表面的作用方式
化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学 反应，生成新的共价键。
物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。
3. 玻片的修饰类型
氨基修饰玻片 同型双功能偶联剂修饰的玻片 硫醇基修饰的玻片 环氧硅烷化修饰的玻片等
背景较高； 灵敏度低。
（2）玻片
优点：耐受高温和高离子强度； 具有不浸润性，提高点样密度； 背景低。
缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。
（3）三维基质包被玻片
具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持 物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。
表1 基因芯片不同载体性能对比
载体类别 膜 玻片
环氧硅烷基
图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意
（5）聚酰胺树形连接分子系统修饰的玻片
图3-9 在硅烷化玻片上生成树形连接分子系统的示意
3.3 探针的制备
1. cDNA探针 2. 寡核苷酸探针 3. 基因组DNA探针（很少用）
cDNA探针：
主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取 RNA后逆转。
寡核苷酸探针：
实心针（solid pin） 裂隙针（split pin） 毛细管针（capillary tube） 针与环（pin and ring）
best
图3-13 Amersham公司的Molecular Dynamics GenerationⅢ Array 点样仪及毛细管点样针
2.非接触式点样（自学） （1）微螺线阀 （2）压电元件
原位合成法
不需要 寡核苷酸
约25nt 需要 不需要 高 高 基因表达，突变检测
直接点样法
需要
寡核苷酸，cDNA，基因组 DNA，蛋白等 不限制
不需要
需要
低
低 基因表达，突变检测，CGH
3.2 芯片载体的制作
1. 常见的载体类型
膜 玻片 三维基质包被玻片
（1）膜
优点：与核酸亲和力强。 缺点：单位面积上点样密度低；
根据数据库中的基因序列人工合成的。 通常在5’末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与 杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)。
手臂分子
特异性探针
表2 寡核苷酸与cDNA 对比
类别 需要 序列
寡核 是 苷酸
cDNA 否
种类 交叉 无
有
点样 密度 高
低
DNA 长度 固定
多样
摩尔 比率 均衡
1.光导原位合成原理
2.高密度的点阵技术
1个平方厘米的面积至少可排列几十万到一百多万个
探针合成区（“点”）
3. Affymetrix独特的PM-MM探针设计
图3-24 PM-MM探针设计方案
高灵敏度
图3-26 仅用PM探针与联合应用PM-MM 探针检测靶序列的灵敏度比较
特异性和灵敏度的提高
第三章 基因芯片的制作方法
3.1 概述
1. 基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础 发展起来的。
反向杂交技术Байду номын сангаас
2. 基因芯片的制作方法：
原位合成法： Affymetrix公司
直接点样法（合成后点样）： Stanford大学，1995年
项目
探针预备 探针类型
探针长度 联合合成 芯片表面点样 密度 制作成本 应用
提高 3. 对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的
一部分，探针浪费严重
Cartesian - PixSys Series
压电元件 1 微螺线阀 1
接触式
非接触式
图3-2 当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况 （图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）
3.5 原位合成法
操作平台
Affymetrix芯片的特点：
光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计
（1）氨基修饰的玻片
羟基
氨基
图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意
（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片
异硫氰基
对苯乙异硫氰酸
醛基
戊二醛
连接分子
手臂分子
特异性探针
图3-6 寡核苷酸探针固定在PDC基片上的原理
（3）连接硫醇基修饰的玻片
硫醇基
图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片
（4）环氧硅烷化修饰的玻片
多样
杂交 速率 快
慢
交叉 杂交 低
高
质量 控制 容易
困难
适应 性 高
低
3.4 点样仪及点样过程
接触式点样 非接触式点样
1. 接触式点样
点样针。 基本过程：
点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象， 使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样 品在基片上留下斑点，完成一次点样。
点样针的种类：
芯片结果准确可靠
图3-25 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较
图3-27 Affymetrix芯片的重复性实验（信号值的散点图）
4. 光导原位合成法的缺点
1. 需要避光掩膜，造价高； 2. 光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的
阵列密度 低 高
所需探针量 高 低
检测方法 放射性 多种
标记 单色 彩色
2. 探针分子与基片表面的作用方式
化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学 反应，生成新的共价键。
物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。
3. 玻片的修饰类型
氨基修饰玻片 同型双功能偶联剂修饰的玻片 硫醇基修饰的玻片 环氧硅烷化修饰的玻片等
背景较高； 灵敏度低。
（2）玻片
优点：耐受高温和高离子强度； 具有不浸润性，提高点样密度； 背景低。
缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。
（3）三维基质包被玻片
具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持 物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。
表1 基因芯片不同载体性能对比
载体类别 膜 玻片
环氧硅烷基
图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意
（5）聚酰胺树形连接分子系统修饰的玻片
图3-9 在硅烷化玻片上生成树形连接分子系统的示意
3.3 探针的制备
1. cDNA探针 2. 寡核苷酸探针 3. 基因组DNA探针（很少用）
cDNA探针：
主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取 RNA后逆转。
寡核苷酸探针：
实心针（solid pin） 裂隙针（split pin） 毛细管针（capillary tube） 针与环（pin and ring）
best
图3-13 Amersham公司的Molecular Dynamics GenerationⅢ Array 点样仪及毛细管点样针
2.非接触式点样（自学） （1）微螺线阀 （2）压电元件
原位合成法
不需要 寡核苷酸
约25nt 需要 不需要 高 高 基因表达，突变检测
直接点样法
需要
寡核苷酸，cDNA，基因组 DNA，蛋白等 不限制
不需要
需要
低
低 基因表达，突变检测，CGH
3.2 芯片载体的制作
1. 常见的载体类型
膜 玻片 三维基质包被玻片
（1）膜
优点：与核酸亲和力强。 缺点：单位面积上点样密度低；
根据数据库中的基因序列人工合成的。 通常在5’末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与 杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)。
手臂分子
特异性探针
表2 寡核苷酸与cDNA 对比
类别 需要 序列
寡核 是 苷酸
cDNA 否
种类 交叉 无
有
点样 密度 高
低
DNA 长度 固定
多样
摩尔 比率 均衡
1.光导原位合成原理
2.高密度的点阵技术
1个平方厘米的面积至少可排列几十万到一百多万个
探针合成区（“点”）
3. Affymetrix独特的PM-MM探针设计
图3-24 PM-MM探针设计方案
高灵敏度
图3-26 仅用PM探针与联合应用PM-MM 探针检测靶序列的灵敏度比较
特异性和灵敏度的提高
第三章 基因芯片的制作方法
3.1 概述
1. 基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础 发展起来的。
反向杂交技术Байду номын сангаас
2. 基因芯片的制作方法：
原位合成法： Affymetrix公司
直接点样法（合成后点样）： Stanford大学，1995年
项目
探针预备 探针类型
探针长度 联合合成 芯片表面点样 密度 制作成本 应用
提高 3. 对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的
一部分，探针浪费严重
Cartesian - PixSys Series
压电元件 1 微螺线阀 1
接触式
非接触式
图3-2 当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况 （图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）
3.5 原位合成法
操作平台
Affymetrix芯片的特点：
光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计
（1）氨基修饰的玻片
羟基
氨基
图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意
（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片
异硫氰基
对苯乙异硫氰酸
醛基
戊二醛
连接分子
手臂分子
特异性探针
图3-6 寡核苷酸探针固定在PDC基片上的原理
（3）连接硫醇基修饰的玻片
硫醇基
图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片
（4）环氧硅烷化修饰的玻片
多样
杂交 速率 快
慢
交叉 杂交 低
高
质量 控制 容易
困难
适应 性 高
低
3.4 点样仪及点样过程
接触式点样 非接触式点样
1. 接触式点样
点样针。 基本过程：
点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象， 使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样 品在基片上留下斑点，完成一次点样。
点样针的种类：