基因芯片第三章基因芯片的制作方法
基因芯片的操作流程及步骤ppt课件
仅有上述5个能同靶DNA杂交。 • 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探
针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂 交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸， 从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大 量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶 DNA 的互补寡核苷酸序列。
生物芯片的制作步骤
细胞
对mRNA进行标记 杂交
基因表达资料
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
基因芯片研制的总体蓝图
检测样品 的制备
获取样品分子的 数量和序列信息
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基因芯片是信息时代的产物
横跨：生命科学、物理学、
计算机科学、微电子技术 光电技术、材料科学 等现代高 科技。
我国第一家批量生产基因 芯片 拥有近2千条基因药物发明专利
• 东南大学吴健雄实验室 • 中科院计算所生物信息学实验室 • 上海生科院
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基因芯片的基本原理
基因芯片的基本原理
基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。
在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。
如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。
1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。
芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。
以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。
所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。
选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。
4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。
目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类组成。
基因芯片第三章基因芯片的制作方法
基因芯片第三章基因芯片的制作方法基因芯片是一种用于检测和分析基因表达的工具，它可以同时测量上千至上百万个基因的表达水平。
基因芯片的制作方法主要包括芯片设计、探针合成、芯片加工和芯片测试等步骤。
下面将详细介绍基因芯片的制作方法。
第一步：芯片设计芯片设计是基因芯片制作的关键步骤，它决定了芯片上每个位置的探针序列。
探针可以是DNA或RNA分子，用于与待测样品中的RNA结合。
探针的设计需要考虑到基因序列的特异性，以及探针长度、探针间隔等参数的选择。
设计好的探针序列将被用于后续的探针合成。
第二步：探针合成探针的合成常常采用固相合成技术。
通过在固相合成反应中逐步添加不同的核苷酸单元（A、T、G、C），可以合成出具有特定序列的寡核苷酸。
合成好的探针需要经过纯化和检测，确保其质量符合要求。
第三步：芯片加工芯片加工是将探针固定在芯片表面的过程。
目前常用的芯片加工技术有光刻和喷墨技术。
光刻技术是通过在芯片表面涂覆光敏材料，然后使用掩膜和紫外线照射，将探针序列的图案直接写入芯片表面。
喷墨技术则是将合成好的探针溶液喷洒在芯片表面，并利用喷嘴的高精度控制，将探针序列分别定位到芯片上的每个位置。
第四步：芯片测试芯片测试是基因芯片制作的最后一步，也是评估芯片质量和性能的重要环节。
通过将待测RNA样品与芯片上固定的探针进行杂交反应，可以检测每个位置的探针与RNA的结合情况。
一般采用荧光探针或放射性标记物等技术，将杂交信号转化为可测的荧光强度或放射性强度。
通过对杂交信号的分析和比较，可以得到样品中各个基因的表达水平。
总结起来，基因芯片的制作方法包括芯片设计、探针合成、芯片加工和芯片测试等步骤。
这些步骤的顺序和操作都对基因芯片质量和性能有重要影响，因此需要严格控制每个步骤的条件和参数。
随着技术的发展，基因芯片的制作方法也在不断更新与改进，以满足对基因芯片在生物医学和生命科学领域的研究应用需求。
AFFYMETRIX基因芯片操作流程
AFFYMETRIX基因芯片操作流程第一章真核靶片断制备<一> RNA的抽提一、哺乳动物细胞或组织RNA的抽提1.总RNA使用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit成功抽提哺乳动物细胞总RNA.哺乳动物组织作为RNA的来源，建议使用TRIzol抽提总RNA.2.Poly(A)+mRNA哺乳动物细胞使用QIAGEN’s Oligotex Direct mRNA kit,从总RNA中抽提mRNA .哺乳动物组织作为RNA的来源，应首先使用TRIzol纯化，再进行一个Poly(A)+mRNA分离步骤或使用kit.二、RNA沉淀1.总RNA在用RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA.调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。
注：为获得足够量的标记cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX建议开始合成cDNA的Poly(A)+mRNA最小浓度为0.02μg/μl时的最小量是0.2μg, 总RNA最小浓度为0.5μg/μl时的最小量是5μg.这样有两个好处：（1）有足够量在各步检查样品浓度和质量（2）制备足够的cRNA用于杂交在TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法.2. Poly(A)+mRNA大多数Poly(A)+mRNA分离过程都会导致得到较稀浓的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA.3.沉淀步骤：（1）加1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇.（2）混匀，-20℃放置最少1小时.（3）4℃,≥12000x g离心20分钟.（4）80%乙醇洗涤沉淀2次.（5）空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥.（6）DEPC处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA合成中需要的RNA的浓度和量来决定.先阅读cDNA合成的过程来决定这一步的适合溶解体积.4.RNA测定用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1单位吸光度等于40μg/mlRNA.●需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度●A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)<二>由纯化的总RNA合成双链cDNAAFFYMETRIX强烈建议HPLC纯化T7-(d7)24 primer一、第一链cDNA合成开始RNA的量:高质量RNA5.0μg -40.0μg纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40μg/mlRNA），A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。
基因芯片实验原理与方法
长征途中的感人故事（精选5篇）长征途中的感人故事篇1长征，是决定中华人民是否能站起来的重要决策，长征路上无数英雄人物用自己的胸膛，堵住了敌人的炮火，许多热血青年纷纷加入共产党，在那艰难的长征路上，是战士们用自己的身躯，才铺平了我们如今幸福的生活道路。
在长征路上，战士要走过草地，那草地一望无际，只要一不留神，就有可能陷入沼泽。
战士们的粮食吃完了，只能忍饥挨饿。
他们一天走200多公里的路，休息的时候坐下，可有的战士坐下就再也站不起来了。
穿过草地，他们又面对着一座座雪山的挑战，战士们一个个毫不犹豫的上了山。
在雪山上，他们每时每刻都有可能面临掉下去与雪崩的危险，他们饿了就杀马吃、后来就用皮带、棉花、草根来充饥，战士们的体力已经快支撑不住了，便走一百步休息一下，后来减到三十步，就不能再减了，如果再减的话，就会永远长眠在雪山上了。
过雪山时，战士们在零下30度穿着单衣，一个个冻的手发红。
牺牲的战士5个人或6个人一起埋在雪地里，剩下的战士望着那里恋恋不舍的含泪而去，那些英勇的战士翻越了20多座雪山，受尽了磨难，牺牲了成千上万名战士。
长征终于胜利了!中华人民站起来了!长征，我为你骄傲，为你自豪，泪水与血水汇成了一条小溪，翻起朵朵长征事迹的浪花，在这幸福的岁月里，这条小溪依然在人们心中流淌着……长征途中的感人故事篇2去年暑假，我读过一本让我深深感动的书——长征路上的故事。
红军在长征的时候，遇到了许多的困境：红军要过的草地是荒芜人烟的，甚至连鸟兽也没有，只有大片大片绿油油的水草，一不小心，就会踩进烂泥潭，越陷越深;红军一路上衣杉褴褛，在爬雪山的时候经常被凛冽的寒风吹袭;红军过大渡河时，由于敌人先在桥上做了埋伏，把桥上的木板全部都拿掉了，所以让红军很前进，他们一边爬铁索桥，还一边与敌人交战……红军是多么顽强啊!面对这么多的困难，他们毫不退缩。
没有粮食了，他们就用野菜、野果、树皮充饥，有的时候，甚至把自己的枪皮带、皮鞋切成小块，煮了充饥;面对自然环境极其恶劣的夹金山，战士们强帮弱，大帮小，走不动的扶着走，扶不动的抬着走，战士们都豪迈地表示：“一定要让每个战友安全地越过夹金山。
基因芯片的原理、制备及应用
基因芯片的原理、制备及应用摘要：侠义上的生物芯片是将生物分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等）固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵，可分为基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室三类，其中目前应用最广泛的生物芯片是基因芯片。
基因芯片是基因突变分析、基因测序、基因表达研究中的高效手段之一。
其制备有两种方法：原位合成法与交联制备法。
基本原理是利用DNA分子可以变性、杂交的特性，通过基因芯片上固定的探针或样品DNA与游离的样品DNA或探针杂交来推断未知靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。
高效、快速的基因芯片以其无与伦比的优势，已在医学、药学、分子生物学、环境科学及食品安全等领域显现巨大的应用价值，具有非常广阔的发展前景。
关键词：生物芯片；基因芯片；原位合成法；交联制备法生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要通过微电子等技术在固体芯片表面建立微型生化分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速与大量信息的检测。
根据探针分子的不同、研究对象的差异和制作工艺的发展，可大致将生物芯片分为基因芯片（又称DNA芯片、DNA微阵列）、蛋白质芯片（又称蛋白质微阵列）、芯片实验室（lab-on-chip，又称微流控芯片）三大类（当然也有较新的组织芯片、细胞芯片、糖芯片等，但由于应用不如上述三大类广泛，此处不予列出），其中应用最广泛的是基因芯片。
进入21世纪以来，随着人类基因组计划的完成，基因序列数据迅速增长。
如何研究如此众多的基因在生命过程中担负的功能成为一个重要课题，基因芯片正是在这样的背景下应运而生。
基因芯片是基因突变分析、基因测序、基因表达研究的高效手段之一，是生物芯片技术中最基础、发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的领域【1】。
基因芯片是基于核苷酸互补杂交原理研制的，它是指将大量的探针分子固定于固相支持物上然后与标记的样品分子进行杂交反应，通过对杂交信号的监测分析获取样品分子的数量和序列信息。
基因芯片的操作流程及步骤
02
基因芯片操作流程
基因芯片的设计与制备
01
02
03
确定目标基因
根据研究目的，确定需要 检测的目标基因或基因组 区域。
设计探针
根据目标基因序列，设计 特异性捕获探针，确保探 针的特异性、灵敏度和稳 定性。
制备芯片
将探针合成并固定在芯片 基质上，形成基因芯片。
样本准备
样本收集
采集待检测样本，如组织、 血液、细胞等。
背景校正
通过特定的算法和技术，对基因芯片中的背景信号进行校正，排除非特异性信号和背景 噪声的干扰，提高数据的准确性和可靠性。
数据分析与结果解读
数据分析
运用统计分析、机器学习等方法，对基 因芯片数据进行深入分析，包括差异表 达基因的筛选、基因功能注释、通路富 集分析等。
VS
结果解读
根据分析结果，结合生物学知识和文献资 料，对基因表达谱进行解释和推理，揭示 基因之间的相互作用和调控关系，为后续 实验提供理论依据和指导。
06
应用实例
基因表达谱分析
目的
了解不同组织或不同生长条件下基因的表达情况，寻找差异表达基 因。
操作步骤
提取组织或细胞的总RNA，逆转录为cDNA，将cDNA标记后与基 因芯片进行杂交，洗涤、检测并分析结果。
注意事项
确保RNA质量、标记效率和杂交条件的优化。
单核苷酸多态性检测
目的
检测基因组中单核苷酸的变异，如SNPs，了解遗传变异与疾病的 关系。
交，洗涤、检测并分析结果。
注意事项
03
确保DNA标记效率和杂交条件的优化，注意控制实验条件和背
景噪音。
THANKS
感谢观看
核酸提取
从样本中提取出所需的核 酸（DNA或RNA）。
怎么做基因芯片实验
、基因芯片分析技术1基因芯片的概念基因芯片，亦指DNA微阵列，是将大量DNA片段有规则地固定在某种介质上，从而检测特定基因表达地一项技术。
这项技术的基本原理是分子生物学中常用的杂交方法的扩展，其基本做法是将要检测的样品加以标记，然后与做成的阵块进行充分杂交，再加以洗脱后，用图像显示出结果。
这里，在阵块中排列的DNA片段应是已知的序列。
根据这种概念，我们可以看出，在这项技术中，有如下三点是非常关键的。
其一，要有大量已知序列和基因片段。
随着人类基固组计划的实施，我们可以得到大量基因序列信息，可以将一个文库的所有cDNA序列测到并加以记录，从而可以将一个文库排列成一个DNA阵列。
因此，从理论上讲，可以做成从微生物到人类各组织器官的文库阵列。
其二，从工艺的角度讲，要求能够将不同的DNA片段以很高的密度"点印"在普通载载玻片大小的介质上，从而使得在很小的面积上可以排列成千上万个基因而不致于相互混杂，这个过程要求相当高水干的工艺技术。
其三，要有-种很好的检测手段。
目前看来，用不同的荧光标记核酸来进行检测是一种比较简单，而且安全可靠的方法。
同时，不同的荧光可以使得我们同时检测几种样品。
这样，对于差异显示这类实验来说，就显得尤为简便。
基因芯片一股可分为两处，一种为"点印"阵列，一种为直接合成阵列。
"点印"阵列是将较大的片段(大于100bp)物理地固定在介质上，而直接合成阵列则是直接在介质上合成较短的片段。
一般而言，DNA样本都是收集在96孔或384孔板上，这些样本可以是PCR产物，也可以是从质粒上直接得到的片段等。
然后用机械手将DNA通过特制的加样头进行点样。
点样完成后，对介质进行处理以使DNA能够十分稳定地附着在介质上，同时还要使介质尽量减少结合非特异性的探针。
2基因芯片的操作过程基因芯片制作从准备探针(即扩增DNA片段)开始，经过芯片加工、DNA阵列点印、芯片后处理及芯片质量检测等过程，其应用包括RNA制备、标记、杂交及成像分析。
基因芯片的操作流程及步骤
结合患者的基因组信息，基因芯片技术可以 实现疾病的精准诊断，为后续治疗提供指导 。
个性化治疗方案设计
通过分析患者的基因变异信息，可以为每位患者量 身定制个性化的治疗方案，提高治疗效果。
预后评估
基因芯片技术可用于评估患者的预后情况， 为医生制定后续治疗方案提供参考。
06
基因芯片技术挑战与展望
固定化效果检测
通过荧光标记等方法检测 探针的固定化效果，确保 芯片质量。
探针合成与标记
01
探针合成
根据设计序列，通过化学合成方 法合成探针，并进行纯化和质量 控制。
探针标记
02
03
标记效果检测
将合成好的探针进行荧光标记或 其他标记，以便于后续的信号检 测。
通过荧光扫描仪等设备检测探针 的标记效果，确保标记成功且均 匀。
VS
意义
基因芯片技术的出现和发展为生命科学研 究和医学诊断等领域带来了革命性的变革 。它不仅提高了检测效率和准确性，还为 我们提供了更加全面和深入的基因信息， 有助于揭示生命活动的本质和规律，为疾 病的预防、诊断和治疗提供更加有效的手 段。
02
基因芯片制备流程
芯片设计与制造
芯片类型选择
根据实验需求，选择合适的芯片类型，如cDNA芯 片、寡核苷酸芯片等。
质量控制与标准化管理
1 2
实验设计
制定合理的实验设计方案，包括样本选择、实验 重复次数等，以确保实验结果的可靠性和可重复 性。
标准化操作
建立标准化的实验操作流程和质量控制标准，确 保实验过程中各项操作的准确性和一致性。
3
数据质量评估
采用多种方法对实验数据进行质量评估，如信噪 比、动态范围、重复性等指标，以确保数据的准 确性和可靠性。
《基因芯片技术》第3章-基因芯片检测技术
激发/发射光的识别和分离：由于荧光发射强度要远远小 于激发光强度，因此要从激发光中检测出微弱的荧光信 号，就需要对这两种类型的光进行分离。
激发/发射光的识别和分离
几何分离：根据激发光和荧光光路的几何关系进行 分离。一种方式用一个很小的反光镜将激发光束反 射，而让环形部分的荧光光束通过；另一种方式是 激发光束和系统光路不同轴，在成像过程中，激发 光束所成的像和荧光光束所成的像会发生分离，从 而过滤掉激发光束。
非激光光源
非激光光源，波长范围比较宽。 为了避免激发光对荧光的干扰，通常需要加装 滤光片来选择与荧光最大激发波长相吻合的光。 要检测多种荧光，采用多个滤光片来选择多种 特定的波长。 低氩汞灯和短弧氙灯。
照明方式
照明区域是线和面，可以同时激发大面积的荧 光，实现光强的均匀性，主要是非激光光源。 激光高相干性，在较大面积上光强很难一致。 一般激光光源为点照明方式，为了实现大面积 成像，必须通过扫描来实现。
光电倍增管（PMT）
将光辐射变成电子流 光阴极：执行光电变换 倍增级：执行电子的倍增放大 阳极：收集电子流
光电倍增管（PMT）
增益依赖于光电倍增管内部光阴极的数量和加 在光电倍增管上的电压，光阴极的数量多、电 压高则增益大。 电子数目可增加到108 芯片扫描仪用光电倍增管的选择应考虑下列两 个因素。一是由于不同的光阴极模式对不同的 波长的光的灵敏度不一样，因此应选择对被测 荧光波长灵敏度高的光电倍增管；而是应选择 耐用的高信噪比的光电倍增管。
扫描仪
第一节 基因芯片检测仪
芯片检测体系的硬件部分主要包括： 照明光源 光路系统 光探测器 机械部分 A/D转换器
基因芯片的实验流程
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基因芯片的基本原理及应用
基因芯片的基本原理及应用介绍基因芯片是一种微电子技术在生物学领域的应用，它可以高效地检测和分析大量基因序列。
基因芯片的出现革命性地改变了基因研究的方法，使得科学家可以更快速、更全面地了解生物体的基因表达。
基本原理基因芯片的基本原理是利用固相合成技术在晶片上合成大量的核酸序列探针。
这些探针可以与样品中的RNA或DNA分子特异性结合，从而实现对目标序列的检测和分析。
1.探针设计：探针的设计是基因芯片的核心步骤。
根据研究目的，科学家需要确定所需的目标基因序列，并设计合适的探针。
探针通常包含特异性的DNA或RNA序列，能够与目标分子互补配对。
2.探针合成：探针的合成是基因芯片制备的重要步骤。
合成方式通常采用固相合成技术，即将一系列碱基逐渐加入到固相材料上，从而逐步构建起目标探针序列。
3.样品制备：在进行基因芯片分析之前，需要对待检样品进行预处理。
样品处理的方法包括RNA或DNA的提取、纯化和标记等步骤。
这些操作旨在将样品转化为适合基因芯片分析的形式。
4.杂交反应：基因芯片在接受样品之前，需要先进行杂交反应。
杂交反应是将样品中的RNA或DNA与基因芯片上的探针进行结合的过程。
这个过程中，样品中的目标序列与探针互补配对，形成稳定的杂交复合物。
5.芯片扫描：杂交反应完成后，基因芯片需要进行扫描以获取数据。
扫描过程中，芯片上的荧光信号会被探针所结合的目标序列激发，从而反映目标序列的存在和含量。
6.数据分析：基因芯片扫描得到的数据需要经过严格的数据处理和分析。
科学家可以利用不同的算法和统计方法，从大量的数据中提取出有意义的信息。
这些信息可以用于了解基因表达、发现新的基因和寻找致病基因等。
应用基因芯片在生物学研究中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：•基因表达分析：基因芯片可以同时检测和分析一个组织或细胞中成千上万个基因的表达水平。
这种高通量的分析方法能够帮助科学家发现不同组织或疾病状态下的基因表达差异，从而揭示基因调控网络和生物过程。
基因芯片实验原理及方法
基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。
在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。
如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。
详细实验方法∙基因芯片实验原理与方法实验材料∙组织或细胞样本试剂、试剂盒∙Oligo-dT (T15) - Roche∙dNTPs∙RNasin∙Superscript II∙Cot-1 DNA∙EDTA∙NaOH∙Tris仪器、耗材∙扫描仪：ScanArray 3000∙图像处理软件：Genepix 3.0∙Cartesian 7500点样仪∙硅烷化玻片∙PCR仪器∙Scan Microarray一、目的本实验的目的是学会cDNA芯片的使用方法。
了解各种基因芯片的基本原理和优缺点。
基因芯片这一技术方法在1991年的Science杂志上被首次提出，其高通量、并行检测的特点适应了分析人类基因组计划所提供的海量的基因序列信息的需要，可以说，人类基因组计划是基因芯片技术发展的原因，而对深人研究基因突变和基因表达的有效方法的需求又是促进基因芯片技术发展的动力。
由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点，基诞生以来就受到科学界的广泛关注，正如晶体管电路向集成电路发展的经历一样，分子生物学技术的集成化正在使生命科学的研究和应用发生一场革命。
根据固定在芯片载体上的核酸分子的不同，基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。
寡核昔酸芯片主要基于光引导聚合技术，该技术是Affymetrix公司开发的专利技术，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
二、原理基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。
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（2）玻片
优点：耐受高温和高离子强度； 具有不浸润性，提高点样密度； 背景低。
缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。
（3）三维基质包被玻片
具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持 物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。
表1 基因芯片不同载体性能对比
载体类别 膜 玻片
Cartesian - PixSys Series
压电元件 1 微螺线阀 1
接触式
非接触式
图3-2 当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况 （图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）
3.5 原位合成法
操作平台
Affymetrix芯片的特点：
光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计
阵列密度 低 高
所需探针量 高 低
检测方法 放射性 多种
标记 单色 彩色
2. 探针分子与基片表面的作用方式
化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学 反应，生成新的共价键。
物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。
3. 玻片的修饰类型
氨基修饰玻片 同型双功能偶联剂修饰的玻片 硫醇基修饰的玻片 环氧硅烷化修饰的玻片等
多样
杂交 速率 快
慢
交叉 杂交 低
高
质量 控制 容易
困难
适应 性 高
低
3.4 点样仪及点样过程
接触式点样 非接触式点样
1. 接触式点样
点样针。 基本过程：
点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象， 使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样 品在基片上留下斑点，完成一次点样。
点样针的种类：
第三章 基因芯片的制作方法
3.1 概述
1. 基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础 发展起来的。
反向杂交技术
2. 基因芯片的制作方法：
原位合成法： Affymetrix公司
直接点样法（合成后点样）： Stanford大学，1995年
项目
探针预备 探针类型
探针长度 联合合成 芯片表面点样 密度 制作成本 应用
（1）氨基修饰的玻片
羟基
氨基
图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意
（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片
异硫氰基
对苯乙异硫氰酸
醛基
戊二醛
连接分子
手臂分子
特异性探针
图3-6 寡核苷酸探针固定在PDC基片上的原理
（3）连接硫醇基修饰的玻片
硫醇基
图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片
（4）环氧硅烷化修饰的玻片
提高 3. 对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的
一部分，探针浪费严重
根据数据库中的基因序列人工合成的。 通常在5’末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与 杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)。
手臂分子
特异性探针
表2 寡核苷酸与cDNA 对比
类别 需要 序列
寡核 是 苷酸
cDNA 否
种类 交叉 无
有
点样 密度 高
低
DNA 长度 固定
多样
摩尔 比率 均衡
MM探针的作用： 内参 提高特异性 背景信号 提高灵敏度
芯片结果准确可靠
图3-25 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较
图3-27 Affymetrix芯位合成法的缺点
1. 需要避光掩膜，造价高； 2. 光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的
实心针（solid pin） 裂隙针（split pin） 毛细管针（capillary tube） 针与环（pin and ring）
best
图3-13 Amersham公司的Molecular Dynamics GenerationⅢ Array 点样仪及毛细管点样针
2.非接触式点样（自学） （1）微螺线阀 （2）压电元件
1.光导原位合成原理
2.高密度的点阵技术
1个平方厘米的面积至少可排列几十万到一百多万个
探针合成区（“点”）
3. Affymetrix独特的PM-MM探针设计
图3-24 PM-MM探针设计方案
高灵敏度
图3-26 仅用PM探针与联合应用PM-MM 探针检测靶序列的灵敏度比较
特异性和灵敏度的提高
原位合成法
不需要 寡核苷酸
约25nt 需要 不需要 高 高 基因表达，突变检测
直接点样法
需要
寡核苷酸，cDNA，基因组 DNA，蛋白等 不限制
不需要
需要
低
低 基因表达，突变检测，CGH
3.2 芯片载体的制作
1. 常见的载体类型
膜 玻片 三维基质包被玻片
（1）膜
优点：与核酸亲和力强。 缺点：单位面积上点样密度低；
环氧硅烷基
图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意
（5）聚酰胺树形连接分子系统修饰的玻片
图3-9 在硅烷化玻片上生成树形连接分子系统的示意
3.3 探针的制备
1. cDNA探针 2. 寡核苷酸探针 3. 基因组DNA探针（很少用）
cDNA探针：主要来自cDNA，从细胞或组织中提取 RNA后逆转。
寡核苷酸探针：