应用PHYLIP构建进化树的完整详细过程

一、获取序列

一般自己通过测序得到一段序列（已知或未知的都可以），通过NCBI的BLAST获取相似性较高的一组序列，下载保存为FASTA格式。用BIOEDIT等软件编辑序列名称，注意PHYLIP在DOS下运行，文件名不能超过10位，超过的会自动截留前面10位。

二、多序列比对

目前一般应用CLASTAL X进行，注意输出格式选用PHY格式。生成的指导树文件（DND文件）可以直接用TREEVIEW打开编辑，形式上和最终生成的进化树类似，但是注意不是真正的进化树。

三、构建进化树

1.N-J法建树

依次应用PHYLIP软件中的SEQBOOT.EXE、DNADIST.EXE、NEIGHBOR.EXE和

CONSENSE.EXE打开。具体步骤如下：

（1）打开seqboot.exe

输入文件名：输入你用CLASTAL X生成的PHY文件（*.phy）。

R为bootstrap的次数，一般为1000 （设你输入的值为M，即下两步DNADIST.EXE、NEIGHBOR.EXE中的M值也为1000）

odd number: (4N+1)(eg: 1、5、9…)

改好了y

得到outfile（在phylip文件夹内）

改名为2

（2）打开Dnadist.EXE

输入2

修改M值，再按D，然后输入1000（M值）

y

得到outfile（在phylip文件夹内）

改名为3

（3）打开Neighboor.EXE

输入3

M=1000（M值）

按Y

得到outfile和outtree（在phylip文件夹内）

改outtree为4，outfile改为402

(4)打开consense.exe

输入4

y

得到outfile和outtree（在phylip文件夹内）

Outfile可以改为*.txt文件，用记事本打开阅读。

四、进化树编辑和阅读

outtree可改为*.tre文件，直接双击在treeview里看；也可以不改文件扩展名，直接用treeview、PHYLODRAW、NJPLOT等软件打开编辑。TREEVIEW可以显示BOOTSTRAN值，序列较多（60条以上）的时候打开直接显示有明显的重叠，可以在打印预览中显示，或输出为EMF WMF图片文件看，但是序列较多时BOOTSTRAN值的显示位置比较乱，和序列名称有重叠。

PHYLODRAW的编辑功能较强，可以自由调节X、Y轴的长度。输出格式为BMP、PS格式。缺点是不能直接显示BOOTSTRAN值，包括打开TREEVIEW输出的NEX文件，而且输出的BMP文件不全，类似截屏文件，我用PHOTOSHOP进行拼接合成，添加BOOTSTRAN值和注解符号等。据说也可以将PS文件用记事本打开，改变其中的字号，然后通过ADOBE DISTRILLOR将PS转化为P DF，就可以解决问题。如果发现还有重叠，可以再次改变PS文件中的字号大小，直到合适为止。

NJPLOT可以显示BOOTSTRAN值和分值长度。但是不能调节图片X、Y轴的长度。

建MP,ML树将Dnadist和Neighboot两步分别改为Dnapars和Dnaml，其余步骤相同。据说ML法序列较多是非常耗时，我没有尝试。因为我的序列较多。

也可以用CLASTAL X中的BOOTSTRAN N-J TREE法生成进化树，TREE菜单输出格式选项（OUTPUT FORMAT OPTION）中的BOOTSTRAN LABELS ON 选NODE（节点）。在treeview 里，选择tree菜单,然后把show internal edge lables 的选项打勾了，直接打开生成的文件bootstrap的值就可以显示出来。

下面介绍几个软件的使用。首先是PHYLIP。其是多个软件的压缩包，下载

后双击则自动解压。当你解压后就挥发现PHYLIP 的功能极其强大，主要包括五

个方面的功能软件：i，DNA 和蛋白质序列数据的分析软件。ii，序列数据转变

成距离数据后，对距离数据分析的软件。iii，对基因频率和连续的元素分析的

软件。iv，把序列的每个碱基/氨基酸独立看待（碱基/氨基酸只有0和1的状态

时，对序列进行分析的软件。v，按照DOLLO 简约性算法对序列进行分析的软

件。vi，绘制和修改进化树的软件。在此，我主要对前两种功能软件进行说明。

我们现在有几个序列如下：

Mo3 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGCACGGTACCAT

Mo5 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo6 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo7 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT

Mo8 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT

Mo9 ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo12 ATGTATTTCGTACATTACTG CCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo13 ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

要对这8个序列进行进化树分析，按照上面的步骤，首先用CLUSTALX排列序

列，输出格式为*.PHY。用记事本打开如下图：

图中的8 和50 分别表示8 个序列和每个序列有50 个碱基。然后，打开软件

SEQBOOT，如下图：

按路径输入刚才生成的*.PHY文件，并在Random number seed (must be odd) ?

的下面输入一个4N+1 的数字后，屏幕显示如下：

图中的D、J、R、I、O、1、2 代表可选择的选项，键入这些字母，程序的条件

就会发生改变。D选项无须改变。J 选项有三种条件可以选择，分别是Bootstrap、

Jackknife 和Permute。文章上面提到用Bootstraping 法对进化树进行评估，所谓Bootstraping 法就是从整个序列的碱基（氨基酸）中任意选取一半，剩下的一半