ATCC菌种保藏方法
菌种保藏的原理和方法.ppt
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后 再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一 代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮 保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡 获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌 种与分发菌种的高质量标准。
保藏斜面活化斜面来自2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。
保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面
六、菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基 础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使 用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业 部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）
ATCC15834发根农杆菌使用说明
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
ATCC15834 发根农杆菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01170 ATCC15834 发根农杆菌
基 本 信 息 ：
名称：ATCC15834 发根农杆菌
规格：300ul 甘油菌
储 存 温 度 ： -‐80℃
简 介 ：
注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放
置会导致菌种衰退；
2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；
3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能
正常生长；
4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-
ATCC菌种保藏与使用
LYFO DISK 操作流程
Company Logo
KwikKwik-Stik & Lyfo Disk 推荐生长条件
如何选择最适合的菌种生长条件
1.最初的生长最好是在非选择性琼脂培养基上。 1.最初的生长最好是在非选择性琼脂培养基上。 最初的生长最好是在非选择性琼脂培养基上 除非特殊情况或特别推荐， 除非特殊情况或特别推荐，最初的生长一般不 考虑液体培养基。 考虑液体培养基。这是由于在液体培养基中获 得冻干菌株的纯种比较困难，污染所带来的杂 得冻干菌株的纯种比较困难， 菌可能会过度生长，影响得到目标菌株的纯种。 菌可能会过度生长，影响得到目标菌株的纯种。 2、以下列出可供选择的琼脂培养基和相应的 生长条件，供各实验室培养菌种时参考。 生长条件，供各实验室培养菌种时参考。
方法12 方法12
马铃薯葡萄糖琼脂——55℃ 正常环境，48小 马铃薯葡萄糖琼脂——55℃,正常环境，48小 时。
Company Logo
Company Logowww来自Company Logo
Company Logo
Company Logo
Company Logo
Company Logo
Company Logo
简介与说明： 简介与说明：
微生物的长期保存是一个挑战，生物需要低温贮存并 微生物的长期保存是一个挑战， 尽量提供最少干扰的可能性。然而， 尽量提供最少干扰的可能性。然而，Microbank™ 提供了一种保存液来应对对这个问题。 提供了一种保存液来应对对这个问题。
用途： 用途：
标记颜色的25 标记颜色的25 个小珠被包装容纳在包含保存剂的保 存管里，小珠被冲洗和吸附细菌在上面， 存管里，小珠被冲洗和吸附细菌在上面，之后保存管 在贮存期内保持在-70° 当需要培养， 在贮存期内保持在-70°C，当需要培养，单个小珠 很简单的移出保存管，并直接划线在微生物培养基上。 很简单的移出保存管，并直接划线在微生物培养基上。
实验室菌种保藏的方法
实验室菌种保藏的方法菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。
一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。
因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。
一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。
下面介绍几种常用的菌种保藏方法：1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4。
C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
放线菌、霉菌和有芽匏的细菌一般可保存6个月左右，无芽抱的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。
如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4。
C冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。
这一改进可使菌种的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。
其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
2石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端IC明使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4。
C冰箱内保藏。
使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150〜170。
C烘箱内灭菌Ih;或121。
C高压蒸汽灭菌60〜80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
菌种保藏机构
国内外菌种保藏机构目录中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)(液氮)中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)(液氮)中国林业微生物菌种保藏管理中心( CFCC)(液氮)中国药用微生物菌种保藏管理中心(CPCC)(液氮)中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)(液氮)台湾生物资源保存及研究中心(BCRC)(液氮)ATCC (American Type Culture Collection)美国典型菌种保藏中心(液氮)UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心(-140℃下低温保存)NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心(液氮)CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心(液氮)NCIMB (National Collections of Industrial, Food and Marine Bacterial) 英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(液氮)NCTC (National Collection of Type Cultures) 英国典型菌种保藏中心(液氮)BCCM (Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms) 比利时微生物保藏中心(冷冻干燥)DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种保藏中心(冷冻干燥)NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型菌种保藏中心VKM (Russian Collection of Microorganisms) 俄罗斯微生物菌种保藏中心(液氮)国内外菌种保藏机构简介中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China 英文缩写ACCC),成立于1979年,设在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所(1979-2003挂靠中国农业科学院土壤肥料研究所管理,2003年以后挂靠中国农业科学院农业资源与农业区划研究所管理)。
保藏菌种的方法
保藏菌种的方法
在微生物研究中，保藏菌种是非常重要的一环。
保藏菌种可以保证菌种的纯度和活力，并且方便长期保存和传递。
以下是一些常见的保藏菌种的方法：
1. 冷冻保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用生理盐水或甘油溶液混合菌体，制成菌悬液，然后用干燥冰或液氮冷冻保存。
2. 真空干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后在真空条件下干燥保存。
3. 常温干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌纸片或无菌土壤将菌体均匀涂抹在上面，然后在阴凉通风处晾干保存。
4. 液氮保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后用液氮冷冻保存。
在保藏菌种过程中，需要注意以下几点：
1. 保证菌株的纯度和活力，避免杂菌和死菌的混入。
2. 在保存菌种前，要对菌株进行鉴定和存档。
3. 在保存过程中，要保证温度、湿度、氧气和光照等环境条件
的稳定和适宜。
4. 定期检查保存的菌种，确保其纯度和活力。
综上所述，保藏菌种是微生物研究中不可或缺的一环。
通过选择合适的保藏方法和严格的管理，可以确保菌种的纯度和活力，方便长期保存和传递。
菌种保藏方法
菌种保存方法a.常用有以下方法：1 半固体保存法：将菌落穿刺接种在半固体中，4度存放，一般可以管3－6月2 低温冻存法：接种菌落的肉汤加20％灭菌甘油，置－20或－70度，可存放一年以上。
3 真空冻干法：试最理想的保存方法，但需要特殊仪器b.基因工程菌：1：30%的灭菌甘油与培养好的菌悬液按照1：1的比例混合，分装到1.5ML的离心管中，每关1ML，存于--20度，但仅保存半年就不太好了，最好保存到——70度的低温冰箱中。
也可用10%的灭菌甘油从斜面上洗下保存。
2：菌悬液中加甘露醇和人血白蛋白c.目前菌种的保存方法主要有以下几种:1.传代培养保存法:一般来说,这是最基本的保存法,用斜面,穿刺或其他方法培养的传代菌种,一般要保存在5度,但因类而异,如霍乱,淋球,脑膜炎,厌氧菌,钩体等要保存于37度为宜.2.液体石蜡覆盖保存法:这是传代培养的变相方法,可以适当地延长保存时间,主要适用于霉菌,酵母菌,放线菌,需氧性细菌等的保存.3.载体保存法1)土壤保存法:主要用于形成孢子回孢囊的微生物的保存,特别适用于真菌和放线菌不改变性状的长期保存.(2)砂土保存法:常用于梭状芽孢杆菌和一部分霉菌的保存,可保存数年.(3)硅胶保存法:本法对保存链孢霉菌较有效,对酵母菌的保存也较有效(4)磁珠保存法:用本法保存根瘤菌在室温下至少可保存2年半(5)滤纸保存法:适用于对干燥抵抗力较强的微生物,如油芽孢细菌和葡萄球菌.另外噬菌体,放线菌和丝状菌也可用本法.4.悬液保存法1)蒸溜水保存法:霉菌,酵母菌和放线菌的大部分,使其悬浮于蒸馏水中,可在室温下保存数年,青枯病假单孢杆菌也可用本法.(2)糖液保存法:过去用于保存酵母菌,但现在已不常用.(3)其他悬液保存法:如乳链球菌可用PBS保存,放线菌可用0.125%稀琼脂液保存.5.寄主保存法:一些微生物如一部分病毒,立克次氏体,螺旋体.原虫和少量丝状菌目前只能使活着的动物,昆虫,植物体和寄生微生物等感染并传代,否则不能保存.6.冷冻保存法1)低温冰箱保存法:多说微生物在-20度保存效果良好,(2)干冰保存法:-70度保存,(3)液氮保存法:保存温度克达到-196度,本法可说是使用范围最广的微生物保存法.7.冷冻干燥保存法:使微生物在冷冻状态下,在减压下利用升华现象除去水份,使细胞的生理活动事实上停止,从而长期维持生活状态,本法适用于大多数细菌和放线菌,另外病毒,噬菌体,立克次氏体,霉菌和酵母菌再多数情况下用本法保存.8.冷冻干燥以外的干燥保存法1)常压干燥保存法,(2)菌片封袋干燥保存法,(3)Stamp干燥保存法,(4)Sordelli干燥保存法,(5):L-干燥保存法(真空干燥保存法)d.我们实验室保存菌种的方法是:1 将菌落穿刺接种在半固体中，如加有琼脂的肉汤培养基，4度存放，保存时间较短一般3－4月2 接种菌落的肉汤0.9ml加100％灭菌甘油0.1ml，置－20度冰箱中可以保存一年左右,－70度冰箱或液氮中可放置N年，细胞的保存我们放了近十年，仍然复苏的很好3 基因工程菌的保存：1：为防止基因工程菌质粒丢失或不稳定，保存菌种加入甘油的量应该不大于10%，一般0.9ml的菌液加0.1ml80％高压灭菌甘油－70度冰箱保存e.菌种的保藏:菌种是一个国家所拥有的重要生物资源，菌种保藏（preservation）是一项重要的微生物学基础工作。
微生物的保藏技术
法国标准生物保藏中心
法国国家历史自然博物馆——Algotheque du实验室 菌种保藏中心 Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National d'Histoire Naturelle（ALCP）
ALCP隶属于法国国家历史自然博物馆，主要从事于工 业微生物学，应用微生物学，微生物系统分类学，培养和 保藏方法等方面的研究，以及藻类等微生物的分离，鉴定， 保藏工作。保藏有藻类600种、细菌200种。该中心保藏 的菌种可出售。
日本生物技术研究所微生物菌种保藏中心 Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC)
传代培养保藏
一、传代培养保藏
1 原理 2 优缺点 3 注意事项
传代培养的原理
有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时， 会很快死亡，因此在这种情况下，只能求 助于传代培养保存法。传代培养就是要定 期地进行菌种转接、培养后再保存，它是 最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用 生产菌种的保存。
德国与韩国标准生物保藏中心
德国微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有 9400种细菌、2400种真菌、500种酵母菌、300 种质粒、500种动物细胞、500种植物细胞、170 种动物杂肿瘤、600种植物病毒、90种细菌病毒 等（德文，英文）。
韩国国家农业生物技术研究所——农业微生 物菌种保藏（KACC），保藏有细菌890种、真菌 1581种、酵母菌62种、cDNA 600种（英文）。
二、保藏方法 将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷
冻保存。
菌种保藏的共同注意点：
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是指将某一特定的菌种保存在适当的条件下，以确保其生活和活力，并能够长时间保存下去的过程。
菌种保藏的方法主要有冷冻法、干燥法、液氮法、乳酸法和多核隔离法等。
下面将逐一介绍这些方法及其适用范围。
冷冻法是一种常见的保藏菌种的方法之一。
它是将菌种培养物以低温冷冻保存的方法，常见的保存温度为-80°C或更低。
冷冻法适用于大多数细菌和许多真菌，但对于某些特殊的真菌菌种可能效果不佳。
干燥法是将菌种培养物完全或部分脱水后保存的方法，常见的干燥方法有冻干和真空干燥。
干燥法适用于许多细菌、真菌和酵母菌，而且保存时间较长，但对于一些需较高水分条件的菌种可能不适用。
液氮法是将菌种保存在液氮中的方法，常见的保存温度为-196°C。
液氮法适用于大多数菌种，包括细菌、真菌和病毒。
液氮法的优点是保存时间长，可以达到数十年甚至更长的时间，并且菌种的生活力相对较好。
乳酸法是一种利用乳酸细菌的代谢产物来保藏菌种的方法。
这种方法适用于一些较难保存的菌种，如肠道菌和一些微嗜酸性菌。
乳酸法的原理是将菌种和乳酸细菌一起培养，乳酸细菌产生的乳酸可以降低培养物的pH值，从而模拟菌种在肠道内的环境，达到保藏菌种的效果。
多核隔离法是将菌种分离成不同的细胞核并分别保存的方法。
这种方法适用于一些证明难以保存的菌种，如高度依赖特定环境条件或具有复杂生命周期的菌种。
多核隔离法可以通过分离不同的菌落或以体细胞核和生殖细胞核分离的方式来保存菌种。
以上是几种常见的菌种保藏方法。
不同的方法适用于不同的菌种，选择适合的保藏方法可以确保菌种的长期保存和维持生活力。
在进行菌种保藏时，需要严格控制培养物的纯度和保存条件，以确保保存的菌种的准确性和可用性。
实验室菌种的保藏方法
实验室菌种的保藏方法一、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。
保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。
基因工程菌常采用本法保藏。
二、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
三、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。
它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。
其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。
美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。
菌种科学保藏常用方法
1）生理盐水保藏法；2）蒸馏水保藏法： 瓶口加棉塞，灭菌后备用。
放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中贮藏。 1、斜面低温保藏 （定期移植法）
6、冷冻真空干燥保藏法 每管分装约毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。
❖ 我国常采用的菌种保藏法： 国内、国际常用的菌种保藏法
保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏过程中的死亡。 2、用单核细胞和单菌落移种传代 然后置于160℃烘箱中处理1～2小时；
斜面低温保藏 、液体石蜡保藏 、冷冻干燥法、 斜面低温保藏 、液体石蜡保藏 、冷冻干燥法、液氮超低温法。
六）、冷冻真空干燥保藏法
❖ 1、基因突变 ❖ 2、连续传代 ❖ 3、不良培养条件及不良保藏条件
பைடு நூலகம்
菌种退化的防止
❖ 1、减少传代次数 ❖ 2、用单核细胞和单菌落移种传代 ❖ 3、菌种纯化 ❖ 4、采用良好培养基和培养条件 ❖ 5、科学的保藏
一、菌种保藏的目的
❖ 菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后， 仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、 形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。
斜面低温保藏(定期移植法)
这是一种常用最简便的保藏方法。
为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时 琼脂用量加到％，再加入％磷酸氢二钾、磷酸二氢 钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有 机酸。可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染， 又可隔绝氧气，避免斜面干燥
细菌：1个月，酵母菌3个月，放线菌、霉菌半 年。
液氮超低温法。 分装应在1小时内完成，装后棉花塞好管口。
这是保存斜面菌种和孢子最简单的方法，有效期可达1年以上。 5)拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
菌种保藏的原则
根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，主要是
低温、干燥、缺氧三者，使微生物的代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态，以达到保持纯种优良性 状的目的。
菌种传代与保藏
长期保藏法： -80℃低温保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
标准菌株主要来源 美国菌种保藏中心（ATCC） American Type Culture Collection Center 中国普通微生物菌株保藏中心（CGMCC） China General Microbiological Culture
Collection Center 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） China Center for Industrial Culture Collection 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC） China Center for Medical Culture Collection
5.6.3.4 实验室应有程序和措施以保证标准菌种的安 全，防止污染、丢失或损坏，确保其完整性（具体措 施）。
谢谢！
菌种都应注明 ：名称、标准号、接种日期、传代数、 操作者； 菌种使用记录，流转记录。 销毁记录
菌种传代与保藏
菌种保藏管理要求相关标准： 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测 CNAS CL05 实验室生物安全认可准则 CNAS-CL09 实验室认可准则在微生物检测实验室的应用说
短期保藏法： 传代培养保藏法 液体石蜡保藏法
菌种保藏方法
菌种保藏⽅法菌种保存⽅法a.常⽤有以下⽅法：1 半固体保存法：将菌落穿刺接种在半固体中，4度存放，⼀般可以管3－6⽉2 低温冻存法：接种菌落的⾁汤加20％灭菌⽢油，置－20或－70度，可存放⼀年以上。
3 真空冻⼲法：试最理想的保存⽅法，但需要特殊仪器b.基因⼯程菌：1：30%的灭菌⽢油与培养好的菌悬液按照1：1的⽐例混合，分装到1.5ML的离⼼管中，每关1ML，存于--20度，但仅保存半年就不太好了，最好保存到——70度的低温冰箱中。
也可⽤10%的灭菌⽢油从斜⾯上洗下保存。
2：菌悬液中加⽢露醇和⼈⾎⽩蛋⽩c.⽬前菌种的保存⽅法主要有以下⼏种:1.传代培养保存法:⼀般来说,这是最基本的保存法,⽤斜⾯,穿刺或其他⽅法培养的传代菌种,⼀般要保存在5度,但因类⽽异,如霍乱,淋球,脑膜炎,厌氧菌,钩体等要保存于37度为宜.2.液体⽯蜡覆盖保存法:这是传代培养的变相⽅法,可以适当地延长保存时间,主要适⽤于霉菌,酵母菌,放线菌,需氧性细菌等的保存.3.载体保存法1)⼟壤保存法:主要⽤于形成孢⼦回孢囊的微⽣物的保存,特别适⽤于真菌和放线菌不改变性状的长期保存.(2)砂⼟保存法:常⽤于梭状芽孢杆菌和⼀部分霉菌的保存,可保存数年.(3)硅胶保存法:本法对保存链孢霉菌较有效,对酵母菌的保存也较有效(4)磁珠保存法:⽤本法保存根瘤菌在室温下⾄少可保存2年半(5)滤纸保存法:适⽤于对⼲燥抵抗⼒较强的微⽣物,如油芽孢细菌和葡萄球菌.另外噬菌体,放线菌和丝状菌也可⽤本法.4.悬液保存法1)蒸溜⽔保存法:霉菌,酵母菌和放线菌的⼤部分,使其悬浮于蒸馏⽔中,可在室温下保存数年,青枯病假单孢杆菌也可⽤本法.(2)糖液保存法:过去⽤于保存酵母菌,但现在已不常⽤.(3)其他悬液保存法:如乳链球菌可⽤PBS保存,放线菌可⽤0.125%稀琼脂液保存.5.寄主保存法:⼀些微⽣物如⼀部分病毒,⽴克次⽒体,螺旋体.原⾍和少量丝状菌⽬前只能使活着的动物,昆⾍,植物体和寄⽣微⽣物等感染并传代,否则不能保存.6.冷冻保存法1)低温冰箱保存法:多说微⽣物在-20度保存效果良好,(2)⼲冰保存法:-70度保存,(3)液氮保存法:保存温度克达到-196度,本法可说是使⽤范围最⼴的微⽣物保存法.7.冷冻⼲燥保存法:使微⽣物在冷冻状态下,在减压下利⽤升华现象除去⽔份,使细胞的⽣理活动事实上停⽌,从⽽长期维持⽣活状态,本法适⽤于⼤多数细菌和放线菌,另外病毒,噬菌体,⽴克次⽒体,霉菌和酵母菌再多数情况下⽤本法保存.8.冷冻⼲燥以外的⼲燥保存法1)常压⼲燥保存法,(2)菌⽚封袋⼲燥保存法,(3)Stamp⼲燥保存法,(4)Sordelli⼲燥保存法,(5):L-⼲燥保存法(真空⼲燥保存法)d.我们实验室保存菌种的⽅法是:1 将菌落穿刺接种在半固体中，如加有琼脂的⾁汤培养基，4度存放，保存时间较短⼀般3－4⽉2 接种菌落的⾁汤0.9ml加100％灭菌⽢油0.1ml，置－20度冰箱中可以保存⼀年左右,－70度冰箱或液氮中可放置N年，细胞的保存我们放了近⼗年，仍然复苏的很好3 基因⼯程菌的保存：1：为防⽌基因⼯程菌质粒丢失或不稳定，保存菌种加⼊⽢油的量应该不⼤于10%，⼀般0.9ml的菌液加0.1ml80％⾼压灭菌⽢油－70度冰箱保存e.菌种的保藏:菌种是⼀个国家所拥有的重要⽣物资源，菌种保藏（preservation）是⼀项重要的微⽣物学基础⼯作。
ATCC菌种保藏与使用
Company Logo
注:请严格按照操作流程”、“推荐生长条 件”和“推推荐培养方法”活化标准菌株， 不建议使用实验室自己的方法及文献方法 活化标准菌株，否则菌种供应商不保证菌 株的质量且不提供相应的售后服务。
Company Logo
LYFO DISK 操作流程
巧克力琼脂——35℃，微需氧环境，48-72小时。
方法7
Lowenstein Jensen琼脂或Middlebrook琼脂— —35℃，5%~10%CO2环境或正常环境，7天。 M. fortuitum subsp. fortuitum, M. peregrium 和M. smcgmatis也可以选用胰蛋白 胨大豆琼脂(TSA)和Lowenstein Jensen琼脂或 Middlebrook琼脂一样，只是需额外培养一些时间。
Company Logo
Company Logo
Company Logo
Company Logo
Company Logo
Company Logo
储存与有效期 Storage and expiration
在原装密封瓶或含干燥剂的袋中的KWIKSTIKTM应存放在2℃~8℃。 冻干的微生物制剂在有效期内将保持其规 格和性能，有效期在设备标签上标明。 若出现以下情况则不能使用：
Company Logo
Company Logo
方法1
胰蛋白胨大豆琼脂，非选择性羊血琼脂，标准计数平 板，或营养琼脂——35℃,正常环境，24-48小时。
方法2
非选择性羊血琼脂——35℃，正常环境，24~48小 时。在培养链球菌属和隐秘杆菌属时，CO2环境可提 高其生长。推荐使用5%CO2环境来培养肺炎链球菌 和其他甲型溶血性链球菌。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ATCC菌种保藏方法
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。
菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
菌种保藏的方法有哪些呢?
传代保存法
有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
液体石蜡覆盖保存法
该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行菌种保藏。
悬液保存法
即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。
常用的有：
① 蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。
本法应注意避免水分的蒸发。
② 糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。
除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
冷冻干燥保存法
它的原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。
从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此可以达到长期维持生命状态的目的。
该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)
的保存。
在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题：
a.冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。
一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好，如细菌应达到109～1010/ml。
b.菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。
c.安瓶的准备：将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。
d.添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。