两种碘化丙啶染色DNA定量方法检测HL_60细胞凋亡结果的比较_徐晓雪

两种碘化丙啶染色 DNA 定量方法检测 HL-60 细胞凋亡结果的比较
徐晓雪1 户乃丽1 孙丽娜2 孔 璐3*
（ 1． 首都医科大学医学实验与测试中心，北京 100069； 2． 首都医科大学基础医学院药理学系，北京 100069； 3． 首都医科大学基 础医学院生物化学与分子生物学系，北京 100069）
基金项目： 国家自然科学基金面上项目（ 81272406） 。This study was supported by National Natural Science Foundation of China（ 81272406） ． * Corresponding author，E-mail： konglu@ ccmu． edu． cn 网络出版时间：2014 － 12 － 09 16∶ 05 网络出版地址：http： ∥www． cnki． net / kcms / detail /11． 3662． Ｒ． 20141209． 1605． 027． html
的各组细胞悬液各加入 1 mL ＲNA 酶溶液，37 ℃ 反应
图 1 活细胞凋亡检测结果 Fig． 1 FITC Annexin V apoptosis analyse
A： unlabeled control； B： normal cells； C： camptothecin treated cells； FITC-A： fluorescein isothiocyanate Annexin V．
2014 年 12 月 第 35 卷 第 6 期
首都医科大学学报 Journal of Capital Medical University
Dec． 2014 Vol. 35 No. 6
［doi： 10． 3969 / j． issn． 1006-7795． 2014． 06． 028］
· 技术方法 ·
1） 凋亡检测： 对正常细胞和刺激凋亡细胞同时进
3） 显微镜观察： 每例 PI 染色标本在荧光倒置显
行 FITC Annexin V 标记凋亡检测。样品离心，弃去上 微镜下进行形态学观察，采集相差和荧光叠加图像， 清，细胞计数，各取单细胞悬液含有 3 × 105 个细胞，加 同时显示细胞结构和荧光标记情况。
11． 99 ± 2． 27
26． 75 ± 1． 87
0． 00
0． 00
* DNA synthetic phase．
图 3 PI 染色 HL-60 细胞相差与荧光叠加图像 Fig． 3 Phase contrast and fluorescence overlay photographys of HL-60 cells stained with PI
入 5 μL Annexin V-FITC 染液，充分混合，避光，室温下 1． 3 统计学方法
孵育 10 min，同时取相同量细胞加入 5 μL PBS 充分混
各组 DNA 含量分析所得数据使用 SPSS 12． 0 统
合，避光，室温下孵育 10 min，作为未染色对照。再向 计软件进行分析，数据描述采用均数 ± 标准差（ x珋± s）
2． 2 流式 DNA 含量分析结果
个分布，胞膜光滑、完整，胞核圆形，染色均匀，可见分
如图 2 所示，A、B 为正常 HL-60 细胞的两种方法 裂项； 常规染色法： 刺激凋亡组细胞呈聚集分布，胞膜
DNA 定量结果，C、D 为刺激凋亡细胞的两种方法 DNA 褶皱增多，稍不完整，染色较均匀，分裂项形态不清
样本和对照管中分别加入 10 倍 稀 释 的 结 合 缓 冲 液 表示，将两种不同染色方法检测相同样品得到的结果
500 μL，避光，室温下孵育 5 min，全程采用无菌操作， 的百分数值进行配对 t 检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统
流式细胞仪检测。
计学意义。
2） PI 染色 DNA 含量分析： 样品固定： 将单细胞悬 2 结果
1 mL 磷酸氢钠-柠檬酸缓冲液，室温孵育 10 min，300 g 样品的细胞为阳性细胞群，P2 门代表凋亡细胞。对照
（ 相对离心力单位，g = 9． 8 m / s2 ） 离心 5 min，弃上清， 细胞 P2 = 0． 1% ，正常细胞样品 P2 = 2． 6% ，刺激凋亡
加入 PBS 充分混匀。ＲNA 酶处理： 将洗涤后弃去上清 细胞样品 P2 = 31． 7% 。结果见图 1。
取对数生长期 HL-60 细胞以 1 × 105 / mL 的密度 接种于 3 个 6 孔板，每孔接种 1． 5 mL，用含体积分数 为 10% 胎牛血清的 ＲPMI-1640 培养基在 5% （ 体积分 数） CO2 ，37 ℃ ，饱和湿度的细胞培养箱内培养 48 h， 其中 9 孔细胞作为正常培养对照，另外 9 孔细胞中各 加入 5 μL，1 mmol / L 喜树碱溶液，继续培养 2 h。分 别收集各孔细胞，得到 18 个同步培养细胞样品，取正 常培养和刺激凋亡细胞各 1 例，进行 FITC Annexin V 标记凋亡检测，验证凋亡的存在，再将剩余 16 例样品 各自充分混匀后平均分入两管，得两两一对的共 32 例样品，分为 4 组，分别是正常培养细胞常规染色组，
3 讨论
形态清晰，PI 染色明确。常规染色法： 正常细胞组细
作为 DNA 定量检测的经典方法的 PI 染色法被认
胞呈聚集分布，胞膜光滑、完整，胞核圆形，染色均匀， 为可以作为观察细胞凋亡的重要手段之一，但是由于
可见分裂项，胞质可见； 渗透染色法： 正常细胞组呈单 致凋亡因素、凋亡程度及细胞自身条件的差异，仅采
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图 2 DNA 含量直方图 Fig． 2 DNA content histograms of corresponding
HL-60 cells untreated（ A，B） and treated with camptothecin （ C，D） ； Cells represented by A，C histogram were stained by conventional method while those represented by B，D histogram treated by phosphate-citrate buffer rinse method； FL3 LIN： fluorescein three linearity．
定量结果，各组数据统计分析结果详见表 1，对于正常 晰； 渗透染色法： 刺激凋亡细胞组呈单个分布，部分细
细胞两种方法检测结果差异无统计学意义，对于刺激 凋亡细胞两种方法检测结果差异有统计学意义。 2． 3 荧光显微镜观察结果
镜下可见（ 图 3） 细胞经过 ＲNA 酶处理后细胞核
胞发生胞膜皱缩、包膜破裂，胞核皱缩或松散，核染色 变淡或染色区缩小，可见空细胞。
表 1 各组 DNA 含量分析数据统计结果
Tab． 1 The statistical analysis of the data of DNA content analysis
（ %）
Group
Conventional method Phosphate-citrate buffer rinse method P
本实验以 DNA 合成抑制剂喜树碱作用于对数生 长期的 HL-60 细胞，促进细胞凋亡，并用 Annexin V 标 记流式检测确认细胞凋亡存在，比较了常规 PI 单色 DNA 定量检测法与渗透法 PI 单色 DNA 定量检测法
检测正常和凋亡细胞样品的结果，同时对各组细胞进 行了形态学观察。
1 材料和方法
碘化丙啶（ propidium iodide，PI） 是插入性核酸染 料，直接插入双链核酸的 2 个碱基对之间，每 5 个碱 基插入 1 个荧光分子，与核酸的结合均匀、稳定。细 胞经过 ＲNA 酶处理后，PI 可以与细胞内 DNA 特异性 结合，在流式细胞仪上经 488 nm 激光激发，发出峰值 610 ～ 620 nm 的 荧 光，可 以 准 确 的 反 映 细 胞 群 体 中 DNA 含量的分布情况，适用于 DNA 定量检测。根据 细胞周期中不同时项 DNA 的变化来检测细胞周期中 DNA 合成 前 期 （ G0 / G1 期） 、DNA 合 成 期 （ S 期） 与 DNA 合成后期（ G2 期） 各时项的细胞比例。因为 PI 是适用于所有流式细胞仪的染料，这一染色技术在临 床肿瘤诊断和医学科研中被普遍的采用，常规使用的 染色方法是包括固定、ＲNA 酶处理、PI 饱和染色 3 个 关键步骤的 3 步法 PI 染色技术［1］。在一些研究中，当 细胞在生理或病理条件下发生了凋亡，DNA 损伤，细 胞内 DNA 降低，也可以采用 3 步法 PI 染色检测亚 G1 峰（ 也称作凋亡峰） ，用于凋亡细胞比例和特征的分 析［2］。但是在实 际 应 用 中，由 于 凋 亡 时 相 的 不 同，当 凋亡细胞中 DNA 损伤部分没有完全脱出细胞时，往 往检测不到明确可辨的亚 G1 峰，敏感度较低。作为 细胞凋亡检测的经典方法之一的彗星检测［3］，以细胞 在电泳移 动 中 DNA 的 迁 移 形 态 作 为 凋 亡 的 特 征 指 标，此技术中比较关键的一步即采用碱性高渗试剂使 凋亡细胞中断裂的 DNA 碎片脱出细胞，从而在电泳 迁移中呈现出彗星尾样的拖痕，本课题组利用类似方 法，用高渗缓 冲 液 作 用 于 固 定 后 的 悬 浮 细 胞，使 凋 亡 细胞内断裂 DNA 较彻底的脱出细胞外，再进行 DNA 定量检测，提高对细胞凋亡的识别度和敏感性［4］。
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正常培养细胞渗透染色组，刺激凋亡 细 胞 常 规 染 色 30 min，置于室温冷却。PI 染色： 向试管中加入 0． 1
组，刺激凋亡细胞渗透染色组。
mL PI 染液，染色 30 s，流式细胞仪检测，Multicycle 软