微生物学 实验2 细菌的简单染色和革兰氏染色资料

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涂片不易过厚,否则造成局部菌体脱色不完全,而使G-菌呈现革兰氏阳性结果。
2、染色
(1)初染。将玻片置于玻片架上,加适量(以覆盖菌膜为度)结晶紫染液染色1~2 min;倾去 染液,用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗,直至流下的水为无色。 (2)媒染。加卢戈氏碘液一滴,染色1 min,水洗。 (3)脱色。将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20~25s至流出液无色,立即水洗。 (4)复染。滴加蕃红复染2min后,立即水洗至流出液无色。 (5)干燥及镜检。将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。先用低倍镜找到视野后,再 换油镜观察 ,并判断菌体的革兰氏染色反应性。
初染 1~2min
媒染 1min
脱色 20~25s
复染 2min
(五)作业

绘出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图,并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
大肠杆菌(10×100)
枯草芽孢杆菌120(10×100)
大肠杆菌___ 色,革兰氏___性菌;枯草芽孢杆菌120___ 色,革兰氏___性菌。
(六)思考与讨论
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(二)革兰氏染色 (见P12)
1、涂片、固定
(1)涂片——“三区”涂片法。在载玻片的左端先加一滴蒸馏水,用无菌接种环挑取 少量苏云金芽孢杆菌与左边水滴混合;将载玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。在载 玻片的右端加一滴蒸馏水,用无菌接种环挑取少量大肠杆菌与右边水滴混合;将玻片倾 斜使少量菌液延伸至玻片中央。(三区:左区——苏云金芽孢杆菌区;中央区——两种 菌的混合区;右区——大肠杆菌区)。 (2)干燥及固定。步骤同简单染色法。
1、造成革兰氏染色结果不正确(假阳性或假阴性)的主要原因有哪些? 2、如果某一细菌的革兰氏染色结果为红色,能否确定该菌就是革兰氏阴性菌?
下次实验题目:放线菌及蓝细菌的形态观察 酵母菌的形态观察及大小测定
脱色时间对革兰氏染色结果的影响:脱色时间过短,G-菌转呈革兰氏阳性结果; 如果脱色时间过长,G+菌转呈革兰氏阴性结果。 媒染时间对革兰氏染色结果的影响:媒染时间过短,不利于结晶紫与细胞之间 的结合,而使G+菌转呈革兰氏阴性结果;媒染时间过长,而使G-菌转呈革兰氏 阳性结果。
结晶紫 碘 液 95%乙醇 番 红

菌龄对革兰氏染色结果的影响:选取处于活跃生 长期——指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌 体尚未成熟或菌体过老,可能使染色结果呈现相 反的结果。
四、实验步骤
(一)简单染色的步骤 (见P11)
1、涂片:取干净载玻片,火焰灼烧后,横放于玻片架上; 在载玻片中央滴一小滴生理盐水, 用接种环以无菌操作取少许菌体于水滴中(注:不要挑破培养基), 混匀并涂成薄膜(注:涂片不易过厚)。 2、干燥:用夹子夹住载玻片一端(菌膜面朝上),反复通过火焰高处数次, 烘干菌液(注:不能直接在火焰上烘烤,以免菌体变形)。 3、固定:用夹子夹住载玻片一端,迅速通过火焰2~3次, 使菌体固定于载玻片上。 4、染色:将玻片平放于玻片架上,加适量(以盖满菌膜为度)染液于涂片上。 染色时间1-2min。 5、水洗:倒去染液,用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗(切勿将菌膜冲掉), 直至流下的水为无色为止。 6、干燥:将玻片置于玻片架上,自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。 7、镜检:先用低倍镜找到视野后,再换油镜观察 。
实验二 细菌的简单染 色法和革兰氏染色法
一、实验目的
1、学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原
理及步骤。 2、学习微生物涂片、染色技术和无菌操作。 3、巩固显微镜油镜的使用技术。
二、实验原理
1、细菌的简单染色原理
①细菌菌体微小而透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须通过染色来增
加菌体的显示力,从而更清楚地观察到其形态和结构。
细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙,使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出,
而使菌体变成无色,再经番红复染就成为红色。
三、实验器材
1、菌种:
革兰氏染色:培养12 h~16 h的枯草芽孢杆菌120和 培养24 h的大肠杆菌。 2、染色液和试剂: 结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄或蕃红 3、器材: 载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
②在碱性、中性或弱酸性溶液中,细菌菌体通常带负电荷,而碱性染料在电 离时,其分子的染色部分带正电荷(酸性染料的染色部分带负电荷),因此,
碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色。
2、细菌革兰氏染色的原理
G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使 肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内,因此细 菌仍保留初染时的颜色,经番红复染后呈蓝紫色。 G-菌细胞壁的外膜层富含类脂,而且其肽聚糖层次薄、交联度低;乙醇脱色时,
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