免疫细胞化学常用试剂
《组织学制片技术与电镜》习题
《组织学制片技术与电镜》习题第一部分组织学技术和免疫组织化学技术一、选择题（一）A1型题(标准型)1.免疫组化技术的关键步骤是A.标本处理B.抗体的处理与保存C.免疫染色D.设立对照试验E.结果判断2.免疫组化技术的首要试剂是A.抗原B.抗体C.标记物D.固定剂E.洗涤液3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。
B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。
C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。
D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。
E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。
4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的A.1950B.1960C.1970D.1980E.19905.PAP复合物中的酶是A.辣根过氧化物酶B.碱性磷酸酶C.葡萄糖氧化酶D.胃蛋白酶E.胶原酶8.PAP法中的“桥”是A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.第四抗体9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术A.1961B.1975C.1981D.1985E.199010.ABC法中的“桥”是指A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.链霉素亲和素14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色A.4℃B.20℃C.40℃D.37℃E.50℃23．PAS反应是检测组织内的：A.核酸B.脂C.蛋白质D.多糖E.抗原一、填空1、免疫组织化学中最常用的标记物是__________、____________ 、___________、____________。
原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。
免疫组化常用试剂
免疫组化常用试剂免疫细胞化学常用试剂介绍佚名一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛 40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛 40g蒸馏水 400mlB液：Na2HPO4·2H2O 16.88g蒸馏水 300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水 200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
前列腺癌方面免疫组化基础知识
2004版 WHO中， P504s在前列腺癌的阳性率为80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫状腺癌、萎缩性癌、假增生性癌和治疗后前列腺癌中阳性率比较低。而且P504s在12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎缩型腺体以及90%以上的高级别PIN中呈阳性反应。此外，P504s在前列腺以外的肿瘤如尿路上皮癌、结肠癌、肾癌以及良性肾源性腺瘤也可阳性。这表明P504s没有组织特异性，不是前列腺癌的特异性标志物。
α-甲基-辅酶A-消旋酶 (P504s) 2001年Jiang等[12]首次将P504s抗体应用于前列腺癌的诊断。P504s即α-甲基-辅酶A-消旋酶((alpha-methylacyl-CoA racemase)，其基因定位于染色体5P13，它所编码的蛋白由382个氨基酸组成，在支链脂肪酸的β-氧化和衍生过程中起作用。P504s在前列腺癌中高表达，而在正常中前列腺组织中则呈阴性或灶性弱阳性。Jiang等在所检测的137例前列腺癌中阳性率高达100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特异性的标记物。
第二节 染色方法
本科标抗体法 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。
酶的种类及特点 从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。
Cumming（1980）报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章 ，下面介绍两种近年报道的新方法。
免疫组织化学 考试重点
2012年周未班复习要点第一部分名词解释1、IHC 免疫组织化学(Immunohistochemistry;IHC)或称免疫细胞化学(ICC)是根据特异性抗原抗体反应的原理来定位组织或细胞内的抗原或抗体成分。
2、CB 柠檬酸缓冲液（0.01mol/L pH6.0,CB）,主要用于免疫组织化学抗原修复的缓冲液。
3、AR 抗原修复(antigen retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复，可以提高抗原抗体阳性检测率的方法。
4、TBS Tris-HCI缓冲液,常用浓度为0.02M,pH7.8 主耍用于IHC的冲洗和底物溶液的配制。
5、PBS 为0.01mol/L,pH7.4磷酸盐缓冲液,主耍用于免疫组织化学的洗涤。
6、酶消化酶消化主耍用于IHC前暴露抗原决定簇,有利于抗原抗体的检测,提高阳性检测率的方法。
7、抗原决定簇抗原决定簇（antigenic determinant）又称抗原表位（epitope），是可与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基因。
8、基因工程抗体基因工程抗体又称重组技术，它是在充分认识Ig基因结构与功能基础上，应用DNA重组技术和蛋白质工程技术，按照客观需求在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。
9、功能性决定簇在一个具有三维空间结构的天然蛋白质抗原分子中,由于存在于抗原分子表面的抗原决定簇易被免疫细胞所识别,故此称为功能性决定簇。
10、单克隆抗体单克隆抗体是通过细胞融合技术使小鼠脾免疫细胞与小鼠骨髓瘤细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，在体外培养的条件下分泌产生的针对单一抗原决定簇,由单个B淋巴细胞增殖而形成的细胞纯系产生的抗体。
11、多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibodies,PcAb)为免疫动物的全血清(抗血清)含有多个抗原决定簇。
12、隐蔽性抗原决定簇抗原决定簇则被抗原分子本身包绕掩盖在内部，正常情况下不能被免疫细胞所识别，称此为隐蔽性抗原决定簇。
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
免疫组织化学染色试剂
免疫组织化学染色试剂免疫组织化学染色试剂是一种用于免疫组织化学染色的特殊试剂，通过与目标分子发生特异性反应，可使其在组织切片上呈现出明显的颜色反应，从而实现对目标分子的定位和定量分析。
免疫组织化学染色试剂主要包括抗体、底物和显色剂三个主要组成部分。
抗体是免疫组织化学染色的核心，其具有高度的特异性，能够与目标分子发生特异性结合。
根据所需检测的目标分子不同，可选择相应的一抗或二抗进行染色。
底物是抗体与目标分子结合后的标记物，一般通过与抗体结合的酶或荧光染料作为标记物，使其在组织切片上呈现出明显的染色信号。
显色剂是底物与标记物反应后形成的可见颜色产物，通过显色剂的作用，可以直观地观察和分析目标分子的分布和表达水平。
在免疫组织化学染色中，常用的试剂有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等酶标记试剂，以及荧光素酶、碱性磷酸酶和荧光染料等荧光标记试剂。
HRP和AP是常用的酶标记试剂，其优点是灵敏度高、信号稳定，适用于常规显微镜观察。
荧光标记试剂具有高度的灵敏度和多色选择性，适用于荧光显微镜观察。
免疫组织化学染色试剂的选择要根据实验需求和目标分子的特性来确定。
首先要选择合适的抗体，确保其与目标分子具有高度的特异性和亲和力。
其次，根据实验的目的和所需的信号强度，选择合适的标记物和显色剂。
最后，根据实验的具体要求和条件，选择适当的染色方法和试剂浓度，以确保最佳的染色效果。
免疫组织化学染色试剂在生命科学研究中起着重要的作用。
通过对组织切片的染色，可以实现对目标分子的定位和定量分析，从而揭示其在组织中的表达和分布特点。
免疫组织化学染色技术广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、神经科学等领域的研究中，为疾病的发生机制和治疗提供了重要的实验依据。
免疫组织化学染色试剂是一种重要的实验工具，能够实现对目标分子在组织切片中的定位和定量分析。
通过选择合适的抗体和标记物，以及优化试剂浓度和染色方法，可以获得清晰、准确的染色结果。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。
3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。
5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。
b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
Triton X-100溶液(10%,无菌)
北京雷根生物技术有限公司
Triton X-100溶液(10%,无菌)
简介：
Triton X-100又称曲拉通100或聚乙二醇辛基苯基醚，是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）,分子量为646.86，CAS 号为9002-93-1。
它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，免疫细胞化学中Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，其中1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清。
Leagene Triton X-100溶液(10%,无菌)主要由Triton X-100、去离子水等组成，经无菌处理，常用作去污剂或破膜剂。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、按实验具体要求操作。
2、该试剂浓度较高，一般稀释至0.1%-1%后使用。
注意事项：
1、 注意无菌操作，避免细菌等污染。
2、 温度较冷时，有可能产生絮状无或者结晶，应25-37℃温浴至完全溶解。
有效期： 3个月有效。
相关：
编号 名称 R00283 Storage Triton X-100溶液(10%,无菌) 100ml 4℃ 使用说明书 1份
编号 名称 DC0032
Masson 三色染色液 NR0001
DEPC 处理水(0.1%) TC0699
葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法) TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。
免疫组化-1
免疫组织化学技术概述免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。
Immunohistochemistry1.概念采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。
实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
2．发展简史☐1941年Coons 首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
——建立免疫荧光技术。
☐60年代Nakane铁蛋白标记Ab,用酶代替荧光素来标记抗体的方法——建立酶标抗体技术。
☐70年代Stemberger 改良上述技术——建立辣根过氧化物酶-抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
当今使用最为广泛☐1975年建立单克隆抗体技术。
☐80年代Hsu 等建立了抗生物素-生物素（ABC）法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
☐90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展☐2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。
凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。
用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。
常用生化试剂作用
常用生化试剂作用：1、蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，在尿素和SDS中稳定。
一般工作浓度是50—100μg/ml，推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl （pH7.5）,10mM CaCl2。
2、SDS：十二烷基硫酸钠，溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀。
3、IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，常用于蓝白斑筛选及IPTG 诱导的细菌内的蛋白表达等。
IPTG和乳糖的结构相似，所以它和乳糖一样，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。
与乳糖不同的是，IPTG不被β-半乳糖苷酶水解。
常与X-GAL一起用于蓝白斑筛选。
作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。
4、X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，是IPTG的显色试剂，在IPTG的催化下显蓝色。
常跟IPTG一起用与蓝白斑筛选。
5、G418：一种抗生素，对几乎所有的细胞都有毒性，是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
6、DMSO：二甲基亚砜。
实验室常用于作液体层析溶剂，同时用作测试物质紫外消光值上时用作参照物。
能溶于所有烷烃和烯烃。
7、曲拉通X-100：TritonX-100，用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用，能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40。
8、NP-40：很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。
alp酶标记抗体的原理
alp酶标记抗体的原理ALP（碱性磷酸酶）标记抗体是一种常用的生物试剂，用于免疫组化、免疫细胞化学、免疫结构化学等领域。
它的原理是利用碱性磷酸酶与抗体的特异性结合来检测目标分子，通过其催化酶促反应产生颜色或荧光信号，从而实现对待检物质的定量或定位。
ALP是一种胞浆酶，广泛存在于多种生物组织和细胞中，包括肝脏、肠道、骨骼、肾脏等。
它对多种底物具有催化作用，其中一种常用的底物是碱性磷酸酶底物（一磷酸酶酯类化合物），在酶的作用下发生水解反应，产生可检测的产物。
在实验中，将要检测的抗原与特异性抗体充分结合，形成抗原-抗体复合物。
随后，加入ALP标记的二抗，该二抗与抗体结合，形成抗体-二抗-ALP复合物。
这里的二抗是针对主要抗体物种的抗体，例如，如果主要抗体来源于小鼠，那么二抗就是对小鼠抗体的抗血清。
当抗原-抗体复合物与ALP标记的二抗发生特异性结合时，ALP的酶活性被引入到该复合物中。
接下来，加入ALP底物，酶作用下的底物水解反应生成可检测的产物。
这些产物可以是可溶性、可氧化或可荧光化的。
最终，通过测定底物的颜色、吸光度或荧光强度，可以定量检测待测物质的存在量或在组织中的定位分布。
ALP标记抗体的使用具有一定的优势。
首先，碱性磷酸酶是一种稳定的酶，具有较好的耐热性和耐酸碱性能，适用于多种实验条件。
其次，ALP催化的底物水解反应通常产生稳定、可视化的产物，如紫色、蓝色或绿色的染色，方便结果的观察和解读。
此外，ALP标记抗体可以与其他标记方法的抗体（如荧光标记抗体）同时使用，实现多参数检测和多通道分析。
不过，使用ALP标记抗体也存在一些局限性。
首先，底物的选择要与实验样品相适应，以避免可能存在的互相干扰。
其次，抗体-二抗-ALP复合物的稳定性和特异性需要进行充分的验证和控制。
最后，对于某些组织或细胞类型，ALP的表达水平较低，可能需要增加反应时间或采用放大方法来提高信号强度。
综上所述，ALP标记抗体通过利用碱性磷酸酶的酶活性，实现目标分子的检测和定位。
免疫细胞化学步骤
细胞爬片1、PBS清洗标本3次各1 min。
2、冰丙酮固定15 min。
3 、空气干燥5min。
4 、PBS清洗标本3次各2 min。
5 、0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。
6 、PBS清洗标本3次各2 min。
7 、3%H2O2孵育15 min。
8、PBS清洗标本3次各2 min。
9 、滴加一抗，室温或37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液10、PBS清洗标本3次各2 min。
11、滴加试剂1，室温或37℃孵育10~20 min。
12 、PBS清洗标本3次各2 min。
13 、滴加试剂2，室温或37℃孵育10~20 min。
14 、PBS清洗标本3次各2 min。
15、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。
16、蒸馏水洗2次1 min。
17、苏木素复染0.5~1min。
18、自来水洗30min。
19、树胶封片。
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
这是试剂盒和网上的综合。
固定的目的是保持细胞形态尽量与生活时相似，防止细胞内的酶将蛋白质分解而自溶，沉淀或凝固细胞内物质，保持其与组织生活时相仿的成分，使细胞各部分易于着色。
一般涂片如宫颈涂片、痰涂片，涂好后应立即固定。
但如液体很稀薄，含蛋白质很少的尿液、胸腹水等，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量。
(一)固定方法1．浸入法涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。
但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。
Triton X-100溶液(1%)
北京雷根生物技术有限公司
Triton X-100溶液(1%)
简介：
Triton X-100又称曲拉通100或聚乙二醇辛基苯基醚，是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）,分子量为646.86，CAS 号为9002-93-1。
它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，免疫细胞化学中Triton X-100常用浓度为1%和0.3%
Leagene Triton X-100溶液(1%)主要由Triton X-100、去离子水等组成，未经无菌处理，常用作去污剂或破膜剂。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、按实验具体要求操作。
注意事项：
1、注意无菌操作，避免细菌等污染。
2、温度较冷时，有可能产生絮状无或者结晶，应25-37℃温浴至完全溶解。
有效期：3个月有效。
相关：编号
名称R00280
Storage Triton X-100溶液(1%)
100ml 4℃使用说明书1份编号
名称DC0032
Masson 三色染色液DF0135
多聚甲醛溶液(4%PFA)NR0001
DEPC 处理水(0.1%)TC0699
葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)TC1167尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。
免疫细胞化学
免疫细胞化学（immunocytochemistry）是将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
肽类与蛋白质种类繁多，均具有抗原性，当将人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物体内，则产生与该抗原相应的特异性抗体（免疫球蛋白）；将抗体从血清中提出后，结合上某种标记物，即成为标记抗体。
用标记抗体与组织切片标本孵育，抗体则与细胞中相应抗原发生特异性结合，结合部位被标记物显示，则在显微镜下观察到该肽或蛋白质的分布。
用荧光素（常用异硫氰酸）标记抗体，并于荧光显微镜下观察，称免疫荧光术。
如抗体与辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）等结合，进行酶显示后，可在光镜或电镜观察，用于电镜者则称为免疫电镜术（immunoelectronmicroscopy)此外，以铁蛋标记抗体白标记抗体，称铁蛋白标记法,也能用于电镜下观察。
标记抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法：用标记抗体与抗体中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原；②间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物。
通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为广泛。
间接法中较常用的，如过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase anti-peroxidase complexmethod，标记方法PAP法)，该法除需一抗和二抗外，还需要制备HRP标记的抗酶抗体,即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP对标记该抗体，制成稳定的环形PAP复合物。
常用免疫组化试剂介绍完整版
常用免疫组化试剂介绍完整版免疫组化试剂是一类用于检测细胞和组织中特定分子的试剂。
它们能够与目标分子发生特异性的结合反应，通过显色、荧光等方式实现目标分子的定位和检测。
常用的免疫组化试剂有抗体、底物、荧光染料等。
下面将详细介绍常用的免疫组化试剂。
一、抗体单克隆抗体：单克隆抗体是由单个克隆的B细胞分泌的抗体组成。
它们具有更高的特异性和一致性，适用于特定的免疫组化实验。
单克隆抗体一般通过酶联免疫吸附试验或杂交瘤技术获得。
二、底物底物是一种被特定酶催化后能够产生染色或荧光信号的化学物质。
在免疫组化实验中，常用的底物有DAB、VIP、AP、HRP等。
DAB：DAB（3,3'-二氨基联吡啶）是一种常用的免疫组化染色底物。
当DAB与过氧化物酶结合后，在特定条件下会产生棕色沉淀物，用于检测目标分子的位置。
VIP：VIP（维珍纳胶体阳离子）是一种特殊的底物，其在经过过氧化物酶催化后，形成带有阳离子电荷的胶体颗粒。
VIP用于染色后，可以形成黑色沉淀物。
AP：AP（碱性磷酸酶）是一种常用的底物，可以和特定基质反应生成可见或荧光信号。
AP基质有两种常用的类型，一种是快速红色溶液（Fast Red），另一种是紫色溶液。
HRP：HRP（过氧化物酶）是一种广泛使用的底物，在过氧化物酶的作用下可以产生明亮的荧光或染色信号。
HRP染色通常呈现为褐色或黑色。
三、荧光染料荧光染料是一种通过吸收特定波长的光线并在另一个波长下发射荧光的化合物。
免疫组化实验中常用的荧光染料有FITC、TRITC、Cy3、Cy5等。
FITC：FITC（荧光异硫氰酸酯或荧光同硫氰酸酯）是一种常用的绿色荧光染料，其在激发波长为488nm的波长下产生绿色荧光。
TRITC：TRITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用的红色荧光染料，其在激发波长为568nm的波长下产生红色荧光。
Cy3：Cy3是一种荧光发色团，其在激发波长为550nm的波长下产生黄绿色荧光。
Cy5：Cy5是一种荧光发色团，其在激发波长为650nm的波长下产生红色荧光。
细胞培养常用试剂
器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。
实验室中固定液
实验室中固定液、缓冲液配置一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液
P B和P B S是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液------------0(共2页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在～之间，否则需要调整。
L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。
一般情况下，l PB的pH值稍高些，稀释成L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB 的pH。
配制方法为：1．L磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）试剂： NaH2PO4•2H2ONa2HPO4•12H2O配制方法：配制时，常先配制L的 NaH2PO4和L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
（1）L的 NaH2PO4；称取 (或 NaH2PO4•H2O 加重蒸水至1000ml溶解。
（2）L的 Na2HPO4：称取Na2HPO4.•12H2O哦（或 Na2HPO4•7H2O 或Na2HPO4•2H2O ）加重蒸水至1000ml溶解。
（3）L 的PB的配制：取19ml L的 NaH2PO4和81ml L的Na2HPO4•12H2O,充分混合即为L的PB（pH约为～）。
若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
2．L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）试剂：L PB50mlNaCl ～9g(约L)重蒸水至1000ml配制方法：称取NaCl ～9g及L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。
若拟配制L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推7．磷酸盐缓冲液242Na2HPO4·12H2O分子量 = ， mol/L溶液为克/升。
Na2HPO4·2H2O分子量 = ， mol/L溶液为克/升。
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免疫细胞化学常用试剂一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸 150mlKarasson-Schwlt’s PB至1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）试剂：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB 至1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）试剂：对苯醌 4.0g0．01mol/L PBS 1 000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。
此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB 500ml0.01mol/L PBS 500mlTris 约14g浓HCl 少许ECD 10g25%戊二醛 3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS 漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解，应在用前几天配制。
（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。
此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
（2）1% OsO4-PB：试剂：A、2.26% NaH2PO4·2H2O 4.15mlB2.52% 8.5mlC、5.4% 葡萄糖5mlD、OsO4 0.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。
但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。
总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。
目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s 液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamb oni’s液等混合固定液。
二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。