原位杂交实验指导
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种重要的遗传学技术，用于研究基因组的结构、组织和表达。
它可以帮助科学家确定特定基因在染色体上的位置，探索基因在细胞和组织中的活性等信息。
本文将详细介绍原位杂交技术的操作步骤，并分享一些实验中常见的小贴士。
原位杂交的基本原理是将一段与所研究基因序列互补的DNA探针标记上荧光分子等信号物质，然后与待测细胞或组织样品进行杂交反应。
通过观察探针与靶DNA的结合情况，可以确定所研究基因在染色体的位置和组织中的表达情况。
下面是一般的原位杂交实验步骤：1.样品处理：首先，需要准备待测细胞或组织样品。
可以选择直接从动植物或细菌中提取DNA，或采用组织切片的方式。
样品处理的目的是提高探针与靶DNA的结合效率。
2.探针的制备：制备一段与所研究基因互补的DNA探针。
可以通过PCR扩增、化学合成或转录反应等方法制备探针。
为了方便后续观察，可以将探针标记上荧光物质如荧光染料、辣椒素或金纳米颗粒等。
3.免疫组化：为了提高探针与样品中的靶DNA的杂交效率，可以进行免疫组化步骤。
这一步主要是使用特定抗体识别并结合待测物质，如甲醛固定、蛋白酶K处理等。
4.模板DNA的制备：将样品中的DNA固定在载玻片上，通常使用甲基化醛或戊二醛确定DNA在载玻片上的位置。
5.杂交反应：将制备好的探针与固定在载玻片上的DNA进行杂交反应。
这一步通常需要对探针和靶DNA进行变性和再结合等步骤。
6.信号检测：通过显微镜观察杂交产物，在适当的波长下观察荧光信号。
可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备。
接下来，我们来分享一些原位杂交技术的小贴士：1.设计合适的探针：选择合适的探针非常重要。
探针的长度应该足够长，以确保与靶DNA的特异性结合。
此外，为了提高信号强度，可以选择多个标记物如荧光染料标记在同一个探针上。
2.优化杂交条件：杂交时间和温度是影响杂交效率的重要因素。
可以通过调整这些条件来提高杂交效果。
此外，添加高浓度的盐类和保护剂可以提高杂交的特异性和效率。
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法
FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。
-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解----0．2M (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。
2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB ，加蒸馏水至1000ml，混匀------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。
3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃-------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。
-------1/3体积的PBS溶液，-------用Hcl将pH调至7.2，定容，-------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。
（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交实验方法
探针设计方案
4，模板序列：
2，适用种属：
5，探针序列：
1，探针名称 ：
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探针杂交原理
01
02
03
04
05
06
07
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A-石蜡切片mRNA原位杂交步骤
二，碱性磷酸酶显色系统
一，过氧化物酶显色系统
三，荧光显色方法
*
B-冰冻切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统
二，碱性磷酸酶显色系统
三，荧光显色方法
*
适用方法 荧光检测系统 过氧化物酶检测系统 碱性磷酸酶检测系统
石蜡切片
冰冻切片
细胞涂片和 细胞爬片
产品年终工作总结
原位杂交实验方法
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演讲人姓名
mRNA 原位杂交前实验准备
01
02
03
04
05
1，无RNA酶水的处理
2，无RNA酶载玻片的处理
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C-细胞爬片或涂片mRNA原位杂交步骤
01
02
03
二，碱性磷酸酶显色系统
一，过氧化物酶显色系统
三，荧光显色方法
附录
3
2
4
1，DAB的配制和使用方法
4，核固红的配制和使用方法
NBT/BCIP的配制和使用方法
3，苏木素的配制和使用方法
*
流式细胞仪
D-悬浮细胞的mRNA原位杂交细胞流式细胞仪步骤
3，标本的防RNA酶的固定
4，探针的稀释和保存
5，DNA探针需变性
*
原位杂交溶液的配制
1，预杂交液和杂交液的配制 2，20Xssc， 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液的配制 3，0.1mol PBS缓冲液的配制 4，0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制 5，0.1mol TBS缓冲液的配制 6，复合消化液的配制 7，组织细胞打孔液的配制 8，杂交漂洗液 9，过氧化氢封闭液
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍分子生物学是一门研究生物分子结构、功能和相互作用的科学。
原位杂交技术是其中一种常用的实验方法，用于研究DNA或RNA在细胞或组织中的位置和表达情况。
本文将介绍原位杂交技术的使用方法，包括样品准备、探针设计、杂交条件和信号检测等方面。
一、样品准备在进行原位杂交实验前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞、组织或整个生物体。
对于细胞和组织样品，需要进行固定和切片处理。
固定可以使用甲醛或乙醛等化学试剂，切片则需要使用显微刀或切片机。
对于整个生物体样品，需要进行组织切片或冰冻切片处理。
二、探针设计探针是原位杂交实验中的重要部分，用于与目标DNA或RNA序列特异性结合。
探针可以是DNA或RNA，通常标记有荧光染料或放射性同位素。
在设计探针时，需要考虑目标序列的长度、GC含量、互补性和特异性等因素。
同时，还需要选择适当的标记方法和标记物，以便在实验中检测到探针的信号。
三、杂交条件杂交条件是决定原位杂交实验结果的关键因素之一。
杂交温度、盐浓度和杂交时间等参数需要根据目标序列的特性进行优化。
通常情况下，较高的杂交温度和适当的盐浓度有助于提高探针与目标序列的互补性结合。
杂交时间一般在数小时到数天之间，具体根据实验需要进行调整。
四、信号检测信号检测是原位杂交实验中的最后一步，用于观察和记录探针与目标序列的结合情况。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、放射性计数和原位杂交染色等。
荧光显微镜观察是最常见的信号检测方法，可以通过荧光染料的发射和目标序列的位置来确定探针的结合情况。
放射性计数则是使用放射性同位素标记的探针进行测量，通过探针的放射性衰减来判断探针与目标序列的结合情况。
原位杂交染色是一种较为传统的信号检测方法，通过染色剂与探针结合来观察目标序列的位置和表达情况。
原位杂交技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究基因表达、基因定位、基因组结构和染色体变异等方面。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，原位杂交技术可以提供有关生物分子在细胞和组织中的空间分布和功能调控的重要信息。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤(一)原位杂交1、溶液配置：（1）Hybridization buffer（20ml）：Formamide 10ml；20x SSC 5ml；Denhand’s2ml；100mg/ml yeast tRNA 50μL；10mg/ml salmon sperm DNA 1ml；Blocking regent 0.4g；DEPC-water 1.95ml。
（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。
（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。
（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。
（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。
（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。
（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。
（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；N BT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。
2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。
（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。
（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交实验指导
原位杂交实验指导原位杂交原位核酸分⼦杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization)，是⽤已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进⾏特异性结合⽽形成杂交体，然后再使⽤与标记物相应的检测系统，在显微镜或电⼦显微镜下观察细胞内定位。
原位杂交技术可分为直接法和间接法两种。
直接法主要⽤放射性同位素、荧光或酶标记的探针与靶核酸进⾏杂交，杂交后分别通过放射⾃显影、荧光显微镜术或成⾊酶促反应直接显⽰。
间接法⼀般⽤抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显⽰探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交技术已应⽤于基础研究如基因组图,转基因检测,基因表达定位等。
并也深⼊到产前诊断,肿瘤和传染性疾病诊断等临床诊断的领域中。
实验前准备在实验开始前，需准备好所需的试剂，如2×、0.5×、0.2×的SSC缓冲液，DAB 试剂盒和原位杂交试剂盒（其中包含了蛋⽩酶K，预杂交液，杂交液，封闭液，兔抗地⾼⾟抗体，HRP-⼭⽺抗兔IgG）本实验所使⽤的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的F1单道移液器、QSP盒装吸头，湿盒，切⽚缸，温箱，硅化盖玻⽚等本教材主要通过间接法原位杂交来展开实验，⼤体的流程有：样品玻⽚制备，杂交前处理，杂交，杂交后处理以及显⾊。
样品玻⽚制备⾸先制备细胞涂⽚：将2-3滴PBS重悬的细胞液滴于涂有多聚赖氨酸的载玻⽚上，培养箱⼲燥5min。
杂交前处理滴加1µg/ml的蛋⽩酶K稀释液，37°C细胞通透30min后，滴加0.1mol/L 的⽢氨酸溶液终⽌消化。
预杂交：⽤吸⽔纸轻轻吸去多余的液体，滴加20µl的预杂交液，盖上硅化盖玻⽚，37°C湿盒孵育30min。
⽤0.2× SSC缓冲液室温洗三次，每次洗涤5min。
杂交擦去周围多余的液体，滴加20µl的杂交液，盖上硅化盖玻⽚，将切⽚置于90°C环境下孵育10min ，将切⽚置于盛有2× SSC缓冲液的湿盒中，37°C孵育过夜。
原位杂交演示实验讲义
原位杂交演示实验讲义一、组织标本以及器皿的处理1. 实验动物心脏灌流，一方面是除去血液中物质的干扰，另一方面可以更好的保持组织形态。
2. 玻璃器皿常规洗净后应用RNA酶抑制剂，如0.1%的DEPC水溶液，浸泡处理若干小时，然后高压灭菌除去DEPC，最后180℃烘烤4h。
3. 载玻片预处理：常规处理步骤后，180℃烘烤4h，然后APES粘片。
4. 冰冻切片制备。
二、RNA探针制备流程1.总RNA的提取以及反转录制备cDNA：（1）将台式离心机置于4度冰箱预冷；（2）匀浆器头使用前后须作如下处理：a. 3％ H2O2浸泡15-30min；b. 灭菌水冲洗2次，甩净，晾干；c. 匀浆；d. 匀浆后用浓度不高于0.5％的SDS洗液清洗，再用灭菌水冲洗至无白沫；e. 无水乙醇浸泡，干燥，防止生锈；（3）取1ml TIRZOL加入小试管中，同时加入组织块100mg。
若组织块大于100mg，使两者比例保持为1ml ：100mg；（4）匀浆。
匀浆时应将匀浆器转速调到最大，每次转10秒钟，转多次，以防止匀浆器及其内液体过热，导致RNA降解；（5） EP管中匀浆液在室温下放置5min，4度12000×g离心10min；（6）按每1ml TRIZOL液加入0.2ml氯仿，用力振荡15s，混匀后室温放置2-3min，4度12000×g离心15min；（7）将上清液移入另一DEPC处理过的EP管中，按每1ml TRIZOL液0.5ml异丙醇的比例加异丙醇，混匀，室温放置10min；（8） 4度12000×g离心10min后，去净上清；（9） 75％乙醇洗涤沉淀，4度7500×g离心5min，然后去掉乙醇；（10）加适量（40ul） DEPC水或去离子甲酰胺溶RNA，用分光度计测OD260值，计算RNA 含量。
RNA含量（ug/ul）＝OD260×40×稀释倍数/1000。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
原位杂交实验注意事项
原位杂交实验注意事项原位杂交是一种常用的分子生物学实验技术，可以用于检测DNA序列在细胞或组织中的位置和数量。
在进行原位杂交实验时，需要注意以下事项：1. 实验前准备在进行原位杂交实验前，需要准备好所需的试剂和设备。
首先要制备探针，探针可以是DNA或RNA序列，必须与待检测序列有特异性结合。
同时还需要制备标记探针的荧光素或辐射性同位素等标记物质。
此外还需要准备组织切片、蛋白酶、去离子水等试剂。
2. 样品处理在进行原位杂交实验前，需要对样品进行处理。
对于组织切片样品，需要将其固定在载玻片上，并进行脱水和脱脂等处理步骤；对于细胞样品，需要将其接种到载玻片上并进行固定和透明化等处理步骤。
3. 探针标记探针标记是原位杂交实验中非常重要的一步。
标记探针可以使用荧光素或辐射性同位素等方法。
荧光素标记通常使用荧光素同工异构体，而辐射性同位素标记则需要使用放射性同位素。
在进行探针标记时，需要注意避免污染和误差。
4. 杂交反应在进行原位杂交实验时，需要进行杂交反应。
杂交反应通常在高温下进行，可以通过热板或烤箱等设备来实现。
在进行杂交反应时，需要注意控制温度和时间，并保持样品湿润。
5. 洗涤和检测完成杂交反应后，需要对样品进行洗涤和检测。
洗涤可以使用盐水、缓冲液等溶液来去除非特异性结合的探针。
检测则可以使用荧光显微镜或放射计等设备来观察样品中标记的探针。
6. 实验安全在进行原位杂交实验时，需要注意实验安全。
荧光素标记的探针具有一定的毒性，需要避免接触皮肤和吸入气溶胶；辐射性同位素标记的探针则需遵守相关放射防护规定，并严格控制实验室内辐射水平。
综上所述，在进行原位杂交实验时，需要注意以上事项，并严格按照实验步骤进行操作，以获得准确的实验结果。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。
脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。
2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。
稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。
用PBS冲洗。
再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。
5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。
6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。
7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。
（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。
8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。
9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。
10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。
植物原位杂交实验报告
一、实验目的本实验旨在通过植物原位杂交技术，对藜属植物染色体组进行核型分析，以揭示藜属植物染色体组的基本特征，为藜属植物的遗传育种和分类学研究提供理论依据。
二、实验材料与试剂1. 实验材料：- 5种藜属植物（灰绿藜、藜、菊叶香藜、杂配藜及藜麦）- 5S rDNA和45S rDNA探针2. 实验试剂：- 甲醛- 乙醇- 盐酸- 染色剂（如醋酸洋红）- 封片剂三、实验方法1. 材料处理：- 将藜属植物根尖或叶片固定于甲醛溶液中，室温下放置24小时。
- 将固定后的材料置于乙醇溶液中，梯度脱水。
- 将脱水后的材料进行酸解处理，以使染色体解旋。
2. 染色：- 将酸解后的材料进行染色，使用醋酸洋红染色剂进行染色体染色。
3. 探针标记与杂交：- 将5S rDNA和45S rDNA探针进行标记，标记方法采用地高辛标记试剂盒。
- 将标记后的探针与染色后的染色体进行杂交，杂交条件为60℃、24小时。
4. 洗涤与显色：- 将杂交后的染色体进行洗涤，去除未结合的探针。
- 使用地高辛标记试剂盒中的显色剂进行显色。
5. 显微镜观察与拍照：- 使用荧光显微镜观察杂交后的染色体，记录核型特征。
- 使用数码相机拍照，记录实验结果。
四、实验结果与分析1. 核型分析：- 通过荧光显微镜观察，发现藜属植物中存在二倍体（2n2x18）和四倍体（2n4x36）两种倍性。
- 藜麦和灰绿藜为四倍体，其余3种为二倍体。
- 核型公式分别为：藜麦（2n4x3634m）、灰绿藜（2n4x3632m）、藜（2n2x1816m）、菊叶香藜（2n2x1818m）、杂配藜（2n2x1816m2sm）。
2. 染色体特征：- 染色体主要由中部着丝粒染色体（m）和近中部着丝粒染色体（sm）组成。
- 核型类型除菊叶香藜为1B类型外，其余均为2B类型。
3. 双随体分布：- 在藜麦、灰绿藜及藜中，具有分布位置不同、数量不等的双随体。
4. 5S rDNA和45S rDNA位点：- 藜麦和灰绿藜的染色体上存在2对5S rDNA位点和1对45S rDNA位点。
植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法
植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋在此过程应注意避免Rnase的污染。
所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。
所用蒸馏水无需用DEPC处理。
所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。
材料取下后应立即固定。
取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。
配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。
300 ml量为例）1、先打开一个60℃左右的水浴锅。
2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。
3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。
4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。
5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。
6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。
7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。
二、固定材料1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。
注意：所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。
2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。
注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。
3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。
抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。
抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。
一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。
rna原位杂交的主要实验过程及应用
rna原位杂交的主要实验过程及应用RNA原位杂交（in situ hybridization）是一种用于检测细胞或组织中特定RNA序列的方法。
它主要包括以下实验过程：1. RNA样本固定：细胞或组织样本通常需要被固定在载玻片上，常用的固定剂包括乙醛、乙酰丙酮、PFA等。
2. 去除脂质：在固定的样本中，脂质会干扰RNA与探针的结合，因此需要用脱脂剂去除脂质。
3. 探针制备：选择目标RNA序列的互补序列作为探针，并进行标记，通常标记方式有放射性同位素标记（例如32P、35S）和非放射性标记（例如荧光标记、酶标记）。
4. 杂交：将探针与样本进行杂交，杂交通常在高温下进行，以促进RNA与探针的结合。
5. 洗脱：为了去除非特异性结合的探针，通常进行一系列的洗脱步骤，洗脱条件可以根据具体的实验目的进行调整。
6. 可视化与检测：如果探针采用放射性标记，可以将载玻片放置于感光胶片上，在放射性衰变的辐射下使胶片曝光，然后显影胶片以检测探针的信号；如果探针采用非放射性标记，可以直接通过荧光显微镜观察探针的发光信号。
RNA原位杂交主要应用于以下领域：1. 研究基因表达：可以确定细胞或组织中特定基因的表达模式，帮助揭示基因的功能和调控机制。
2. 分析细胞类型和结构：可以确定细胞或组织中特定RNA序列的分布情况，帮助研究细胞类型和组织结构。
3. 病理学研究：可以检测病理变化相关基因的表达水平，帮助了解疾病的发生机制和进展过程。
4. 发育生物学研究：可以追踪特定RNA序列在发育过程中的表达变化，帮助研究胚胎发育和器官形成的分子机制。
综上所述，RNA原位杂交是一种重要的实验技术，可以用于研究细胞和组织中特定RNA序列的表达模式及其在生物学和医学领域的应用。
RNA原位杂交是一种研究基因表达的常用技术，通过将标记有特定探针的RNA与细胞内目标RNA进行杂交反应，用于确定RNA在组织或细胞中的位置和表达水平。
其主要实验过程如下：1. 制备RNA探针：根据研究对象的RNA序列设计合适的探针，可以使用放射性标记，如32P或35S，或非放射性标记，如荧光标记（如FITC，Cy3等）。
原位杂交实验要求及步骤
原位杂交实验要求及步骤原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
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原位杂交
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization)，是用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再使用与标记物相应的检测系统，在显微镜或电子显微镜下观察细胞内定位。
原位杂交技术可分为直接法和间接法两种。
直接法主要用放射性同位素、荧光或酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图,转基因检测,基因表达定位等。
并也深入到产前诊断,肿瘤和传染性疾病诊断等临床诊断的领域中。
实验前准备
在实验开始前，需准备好所需的试剂，如2×、0.5×、0.2×的SSC缓冲液，DAB 试剂盒和原位杂交试剂盒（其中包含了蛋白酶K，预杂交液，杂交液，封闭液，兔抗地高辛抗体，HRP-山羊抗兔IgG）
本实验所使用的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的F1单道移液器、QSP盒装吸头，湿盒，切片缸，温箱，硅化盖玻片等
本教材主要通过间接法原位杂交来展开实验，大体的流程有：样品玻片制备，杂交前处理，杂交，杂交后处理以及显色。
样品玻片制备
首先制备细胞涂片：将2-3滴PBS重悬的细胞液滴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，培养箱干燥5min。
杂交前处理
滴加1μg/ml的蛋白酶K稀释液，37°C细胞通透30min后，滴加0.1mol/L 的甘氨酸溶液终止消化。
预杂交：用吸水纸轻轻吸去多余的液体，滴加20μl的预杂交液，盖上硅化盖玻片，37°C湿盒孵育30min。
用0.2× SSC缓冲液室温洗三次，每次洗涤5min。
擦去周围多余的液体，滴加20μl的杂交液，盖上硅化盖玻片，将切片置于90°C环境下孵育10min ，将切片置于盛有2× SSC缓冲液的湿盒中，37°C孵育过夜。
杂交后处理
轻轻揭去盖玻片，42°C预热的2× SSC缓冲液洗2次，每次5min；37°C预热的0.5× SSC缓冲液洗1次，每次15min；0.2× SSC缓冲液洗1次，每次15min。
滴加封闭液37°C孵育30min，去除多余的液体。
滴加兔抗地高辛IgG，湿盒37°C 孵育30min。
轻轻去除多余的液体，浸泡在PBS中5min。
滴加HRP -山羊抗兔IgG，将切片放入湿盒中37°C孵育30min。
显色
去除多余的液体，滴加新鲜的DAB工作液显色20min后，用蒸馏水终止显色。
最后可在显微镜下观察结果。
结果分析
经过DAB染色后，实验组阳性信号呈棕黄色，位于胞浆中。
疑问解答
Doctor A，您能再跟我们讲解一下探针的选择吗？
可以，其实我们使用的探针是指标记的有放射性或带有其他标记物的单链聚核苷酸片段，用于检验核酸样品中特定核苷酸序列。
选择探针的最基本原则是有高度的特异性。
根据探针的来源，可分为：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和寡核苷酸探针。
每种探针都有优缺点，可根据自己具体的实验进行选择。
与此同时，探针的长度、浓度和标记也是我们选择探针时需要考虑的因素。
探针的长度为50-300个核苷酸最佳，同时在合成时也要考虑模板长度。
探针过长，不容易进入细胞；过短，特异性不高。
探针过长时可用碱水裂解达到长度要求。
对探针的标记主要利用放射性同位素、酶、荧光素、半抗原或生物素标记，其检测系统也十分完善。
放射性同位素灵敏度高，但由于其半衰期短、实验周期长、标记物不稳定以及污染环境等缺陷。
用酶标记的探针由于分子大、穿透力差以及对温度的要求，在组织原位杂交领域运用不广。
荧光素标记便于检测，但荧
光容易淬灭，杂交后的片子无法长久保持。
生物素和半抗原成为探针的首先标记物，被用于间接标记原位杂交，目前最常用的是地高辛，灵敏度更高。
生物素本身是一种半抗原，当由于它可与抗生物素蛋白或链亲和素有更高的亲和力，所以在实际运用中多采用酶标亲和素。
杂交反应的时间可能随着探针浓度的增加而缩短，但在一个相当大的范围内，杂交反应应在4-6h内完成，杂交时间不能超过24h。
反应时间过长，形成的杂交体会自动解链，杂交信号反而会减少。
生物素或地高辛标记的探针浓度为5到8微克每毫升，荧光标记的探针浓度为2.5-4μg/ml。
Doctor A，原位杂交的难度较高，在实验进行过程中，我们需要注意什么呢？
的确，这实验需要注意的细节很多。
刚才已经讲解了有关探针的选择，选择合适的探针已经成功了一大步。
细胞通透化也是这实验的关键，因实验样本不同，选择的通透液和通透消化的时间也不同，此时需要我们自己摸索最佳的通透条件。
此外，要严格控制好杂交的温度和时间，探针种类的不同，杂交温度也略有差异。
探针变性后需冰上放置冷却，以防复性。
在做RNA原位杂交时，要避免RNA 酶的污染。
此外，一定要设置对照实验以较好地分析结果。
Doctor A，我之前遇到过非特异性染色，这是怎么一回事呢？
Miss Q，这是做原位杂交的常见问题。
非特异性染色可能是来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等。
探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。
组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。
如过氧化物酶用3%过氧化氢处理5-10min；10%冰醋酸处理组切片10min,或在底物显色液中加入1Mm/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。
背景颜色深的可能原因是探针浓度过高，信号产生过剩；切片在孵育中干涸；切片未冲洗或冲洗时间过短。
而着色浅则可能为试剂未预温或室温低，可延长孵育时间；探针或靶核酸变性不足，可延长变性时间；杂交不完全，可延长杂交时间。