原生质体培养PPT课件

3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖 内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培 养小滴悬挂在皿盖内。 特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可 做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。
4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果 最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上 面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液 体培养基。 特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细 胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原
（二） 降解细胞壁的酶类 用于植物原生质体分离的酶类： 纤维素酶：
半纤维素酶：
果胶酶：
（三） 材料来源 1、来源
叶片，花瓣，果实组织，花瓣髓部，子叶等，尤其是
叶肉细胞及由各部分形成的培养细胞和悬浮细胞。 2、预处理 1）低温处理 2）等渗溶液处理
（四）分离方法
1、机械分离法
产生质壁分离——释放原生质体 缺点： 原生质体的产量很低；方法繁琐费力；因必 须高度质壁分离，故局限性大。
1、酶的配比和浓度
2、渗透压和稳定剂及PH。
（3）分离原生质体
1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织，收 集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后 获得原生质体。 2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶
组成混合酶液，对材料进行一次性处理。
叶肉原生质体分离纯化
纯化后的叶肉原生质体
二、原生质体的纯化
二、培养方法
wenku.baidu.com1、液体浅层培养
原生质体（约2×105/ml密度）悬浮在液体培养基—将 悬浮物质移到直径为60cm的平皿中（2-3mm为宜）—5-10天 后开始原生质体分裂 特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质 积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和 照相。操作简单，可微量培养，细胞植板率高。但原生质体 沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。
第八章 原生质体培养
目的与要求
掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质 分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植 物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、 产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生 质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植 株的鉴定方法。 具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质 体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。
四、影响原生质体数量和活力的因素
4、质膜稳定剂 为了提高质膜的稳定性和增加原生质体的产量，可
在酶液中添加多聚阳离子和无机钙离子作为质膜稳定剂。
一般添加0.5%-1.0%的葡聚糖硫酸钾或0.1%氯化钙。
四、影响原生质体数量和活力的因素
5、PH 酶液的PH对原生质体的产量和活力影响很大，因植物
材料不同要求也不同，一般为5.5-5.8。如原生质体的供
体材料是植物器官，酶液中应加入PH缓冲剂，以维持稳 定酶液的PH，一般添加0.05-0.1%磷酸盐或3.05.0mmol/L MES.
第二节
一、培养基
1、碳源：葡萄糖
原生质体培养
2、氮源：谷氨酰胺 3、生长物质：生长素与细胞分裂素 4、钙源：可增强稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质 内外的离子交换。 5、渗透压：高渗溶液，培养时一般逐步过渡，通常的渗透 剂是甘露醇和山梨醇。 6、PH5.6～6.0，醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
一、原生质体概念
原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜
包裹着的裸细胞。
二、原生质体培养意义：
1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合， 体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。 2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质， 作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究， 实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。
优点：
能够排除外加酶对离体原生质体的结构和 代谢活性的有害影响。
2、酶分离法 收率高、活力强、完整性好。分离原生质体 最有效。 （1）酶的种类及特点 分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂， 以其所含的主要酶的作用分为： 1、纤维素酶类 2、半纤维素酶类 3、果胶酶类 4、崩溃酶 5、蜗牛酶
（2）酶液的配制
1、沉降法（过滤离心法）：低速离心使原生质体沉于 底部。 2、漂浮法：根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不 同，分离出原生质体。 3、不连续梯度离心法：在离心管中首先放入不同浓度 的Ficoll溶液，构成不同梯度，在上部滴入1-2ml酶—原 生质体混合液，在150g离心5min，不同比重的原生质体 漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管手机原生质体， 悬浮洗涤备用。
解时间不宜过长，最好不超过8h。木本植物细胞壁成分
坚厚，半纤维素较多，适当添加半纤维素。
四、影响原生质体数量和活力的因素
3、渗透压稳定剂
主要有两类：一类由糖醇或可溶性糖组成的有机溶 液，目前大多采用这一类，一般使用甘露醇或山梨醇， 也有的使用蔗糖，使用甘露醇者最多。一类是无机盐类， 由氯化钙、硫酸镁、氯化钾或培养基中的无机盐组成。 优点是原生质体的产量高，缺点是可降低细胞壁降解酶 的活性，使高浓度的无机盐进入细胞内，从而影响培养 效果。
三、原生质体活力的测定
1、荧光素二乙酸法
2、染色识别
用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色。
3、形态识别 形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原
生质体即为存活的。
四、影响原生质体数量和活力的因素
1、供试材料 一般选用继代后 处于旺盛分裂时期的淡黄色、颗 粒状的愈伤组织、悬浮细胞系或生长健壮植株上的较幼 嫩外植体。 2、酶的种类、组合和酶解时间 选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性及 酶活性大小确定适宜的酶液组合。酶浓度不宜过高，酶
2、平板法培养 原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养
基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养—5-7天原
生质体开始分裂 特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞 株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生 质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。
第一节
原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离 （一） 植物细胞壁的结构及其化学组成
1、植物细胞壁：初生壁：纤维素、半纤维素、果胶 次生壁：纤维素、半纤维素 2、相邻细胞的初生壁间有中层（胞间层）： 果胶酸钙、果胶酸镁 果胶化合物是一种可塑性大且高度亲水的交替，可 使相邻细胞粘在一起，并有缓冲作用。