分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
蔗糖酶米氏常数的测定预习报告
蔗糖酶米氏常数的测定预习报告一、实验目的1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响。
2.学习测定米氏常数的原理和方法。
二、实验原理在酶的研究应用中，人们经常会遇到底物浓度对酶反应速度的影响的问题。
Michaelis 和Menten 得到了一个表示底物浓度与反应速度之间相互关系的方程式，称为米氏方程式。
][][S Km ＋S νυ=式中v 为最大反应速度，Km 为米氏常数。
由上式可见，米氏常数是当酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
其单位是浓度单位，一般用mol/L 或mmol/L 表示。
米氏常数是酶的特征性物理常数。
一种酶，在一定的实验条件(25℃，最适pH)下，对某一种底物，有一定的Km 值。
不同的酶有不同的Km 值。
因此，测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段。
米氏常数的求法很多，但是，最常用的是LineweaVer —Burk 的作图法(双倒数作图法)。
将米氏方程式改写为下列倒数形式：实验时，选择不同的[S]，测定相应的v ，求出两者的倒数，以1/[S]为横坐标，以1/[v]为纵坐标作图，绘出一条直线(图84-1)，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km 。
此法由于方便而应用最广，但亦有缺点，实验点过分集中于直线的左端，因而作图不易十分准确。
图84-1 酶促反应速度倒数与底物浓度倒数的关系曲线三、实验用品1.器具：722分光光度计、恒温水浴试管、吸量管、秒表、坐标纸、血糖管。
2.药品：⑴0.1mol/L蔗糖溶液⑵0.2mol/L NaAc缓冲溶液(pH4.6)⑶lmol/LNaOH溶液，2mol/LNaOH溶液⑷3,5-二硝基水杨酸试剂：称取10g 3,5-二硝基水杨酸溶于200ml mol／L NaOH中，加入300g酒石酸钾钠·4H2O，再用去离子水稀释至2000ml。
3.材料：自制蔗糖酶溶液。
四、实验方法1.取试管12支，按1～12编号，1号为空白。
2.按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入12支试管中，于35℃水浴中保温10min。
蔗糖酶的分离提纯
蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
我们实验室的研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲CH 2OHH OHHHOHCH 20H液；(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【实验操作】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
《物理化学实验》课程实验教学大纲
《物理化学实验》课程实验教学大纲一、实验课程名称：中文名：物理化学实验英文名：Physical Chemistry Experiment二、课程性质：必修课三、开放实验项目数：0四、适用专业及年级：化学师范、应用化学专业、化学工程与工艺三年级五、实验教科书、参考书：（一）教科书1、东北师范大学等校编《物理化学实验》高等教育出版社 2002年（二）参考书1、复旦大学等校编《物理化学实验》高等教育出版社 2000年2、上海师范大学物理化学教研室自编《物理化学实验》六、学时学分：1、化学师范：课程总学时：90 实验学时：90 课程总学分：52、应用化学专业：课程总学时：90 实验学时：90 课程总学分：43、化学工程与工艺专业：课程总学时：72 实验学时：72 课程总学分：2七、实验教学的目的与基本要求：目的：培养学生熟悉物理化学实验基本方法,掌握物理化学实验中的基本技术(如控温和测温技术、量热技术、差热分析技术、压力测量技术、真空技术、电化学测量技术、光学技术、磁学测量技术等)，加深对物理化学基本理论的理解和提高运用这些基本理论的能力。
基本要求：通过物理化学实验，要求学生能掌握物理化学的基本实验技术和技能，学会重要的物理化学性能测定，掌握物理化学实验仪器设备的基本原理和操作技术，熟悉物理化学实验现象的观察和记录，实验数据的测量和处理，实验结果的分析和归纳等一套严谨的实验方法，培养严格的科学实验态度和增强解决实际化学问题的能力。
八、实验课考核方式：（1）实验报告：实验报告要求用专门的物化实验报告纸撰写，其中需要作图的内容用方格纸作图。
实验报告应包含实验目的、实验原理、实验过程、对原始数据的记录、处理、分析、及对实验结果的总结和相关参考资料的说明。
（2）考核方式a. 第一学期笔试、第二学期操作；b. 平时实验成绩平均分占实验课成绩70%，实验的考核成绩占实验课成绩30%。
九、实验课程内容及学时分配：注：实验1-12：化学师范、应用化学和化学工程与工艺专业均必做；实验13-16：化学师范和应用化学专业必做，化学工程与工艺专业选做；实验17-18：化学工程与工艺专业必做；化学师范和应用化学专业选做。
分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
分光光度法测定蔗糖酶的米是常数一．实验目的：1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数M K 和最大反应速率m ax v 。
2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系3. 掌握分光光度计的使用方法二．实验原理：酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。
它表现出特异的催化功能，因此叫生物催化剂。
酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。
在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时，总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率，反应速率最大。
Michaelis 应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应速率和底物浓度的关系：sM s c K c v v +⋅=max 米氏常数M K 是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。
测定不同底物浓度时的酶反应速率，为了准确求得M K ，用双倒数作图法，可由直线方程：maxmax 111v c v K v s M +⋅= 以v1为纵坐标，s c 1为横坐标，作图，所得直线的截距是m ax 1v ，斜率是m ax v K M ，直线与横坐标的交点为MK 1-。
本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。
该反应的速率可以用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系，因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。
所以测量不同底物（蔗糖）浓度s c 的相应反应速率v ，就可用作图法计算出米氏常数M K 值。
三．仪器与试剂：高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml ）9支；称液管（1ml ）10支；称液管（2ml ）4支；试管（10ml ）10支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS ）；0.1mol.dm -3醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。
分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性
蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。
蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。
对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。
【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。
UDPG+果糖---蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。
该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。
蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。
蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。
实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。
酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。
一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。
果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。
蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。
【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。
14 生物化学实验--酵母蔗糖酶米氏常数的测定
酵母蔗糖酶米氏常数的测定【目的】1 ．掌握蔗糖酶米氏常数测定的方法及原理。
2 ．熟悉蔗糖酶米氏常数测定的及意义。
3 ．验证底物浓度对酶促反应速度的影响。
【原理】当环境温度、 pH 和酶浓度等条件一定时，酶促反应的初速度（V ）随底物浓度 [ S ] 增高而加快，直至达到一个极限，即最大反应速度（V max ）。
依据底物浓度与酶促反应初速度的这种关系，米–曼（ Michaelis-Menten ）氏推倒出如下公式，称为米–曼氏方程式（式 3-1 ）。
方程式中 K m 称为米氏常数， K m 是酶的特征性常数，等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度， K m 可以近似地表示酶与底物亲合力的大小， K m 愈小，表明酶与底物的亲合力愈大。
测定 K m 是研究酶促反应动力学的一种主要方法。
林–贝（ Lineweaver-Burk ）氏将米–曼氏方程式等号两边取倒数得到的双倒数方程为林–贝氏方程式（式 3-2 ）。
实验选择不同的 [S] ，测定相对应的 V ，以 1/V 对 1/[S] 作图，得到一个斜率为 K m /V max 的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴上截距即﹣ 1/ K m （图 3-7 ），由此求出 K m 。
V = （式 3-1 ）= ? + （式 3-2 ）斜率： K m /V maxY 轴截距： 1/V maxX 轴截距：﹣ 1/K m图 3-7 双倒数作图法本实验以酵母蔗糖酶为例。
应用制备的酵母蔗糖酶，在 pH5.0 的醋酸缓冲液中，30 ℃ 条件下测定其 K m 值。
其过程是：当酵母蔗糖酶在有缓冲液存在时与不同浓度的蔗糖混合，保持反应液的温度30 ℃ ，反应 5min 后，测定还原糖生成量（还原糖的定量测定，参见第 3 篇实验 18 ）。
以还原糖的生成量代表反应开始阶段的初速度 ( V ) ，按照 Lineweaver–Burk 作图法求得 K m 值。
【器材】1 ．中号试管2 ．刻度吸量管3 ．微量移液器4 ．恒温水浴箱5 ．冷冻离心机6 ．分光光度计【试剂】1 ． 0.2M pH5.0 醋酸缓冲液0.2M 醋酸 30ml 与 0.2M 醋酸钠 70ml 混合2 ．醋酸钠3 ． 1 M 醋酸4 ． 0.03M 蔗糖溶液(1) 蔗糖的纯化：在做实验前 , 用 Bendiet 氏试剂检验蔗糖中是否有还原糖存在，如果有还原糖则需要将蔗糖纯化，纯化利用蔗糖和还原糖在乙醇中溶解度的差异 ( 表 3 -7 ) ，蔗糖在绝对量上最多，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。
分光光度法测蔗糖酶米氏常数_数据处理方法
For i = 2 To n c4 ( i ) = ( a2( i ) - b1) / mL ∋葡萄糖的浓度 V ( i ) = c4( i ) / t ∋蔗糖的反应速度
Nex t i c = 0 ( d = 0 ( Sxx = 0 ( Syy = 0 ( Sxy = 0 ∋最小二乘法直线拟合 For i = 2 T o n c = c + X( i ) (d = d + Y( i ) Nex t i ax = c / ( n- 1) (ay = d / ( n- 1) For i = 2 T o n xt = X( i ) - ax ( yt = Y ( i ) - ay Sx x = Sx x + xt * xt ( Sy y= Sy y+
For m1. H ide
∋隐藏窗体 For m1
co( 1) = Val( T ex t 7. T ex t ) ∋将对象 T ex t7
的 T ex t 属性转换为数值赋给数组元素 co ( 1)
yt* yt ( Sxy= Sxy+ xt* yt
Nex t i
K2 = Sxy / Sx x ( b2 = ay - K 2 * ax ( r2 =
的学说, 导出了著名的米氏方程, 即
V = V max & Cs / ( Km+ Cs) .
( 1)
式中 V 为反应速率, Cs 为底物浓度, Km 为米氏
常数.
米氏常数是反应速率达到最大值的一半时的
底物浓度, 即当 V = 1/ 2V max 时, Km = Cs, 基于
这一点, 测定不同浓度时的酶反应速率,
1 实验原理
酶是由生物体内产生的具有催化活性的一类 蛋白质, 表现出特异的催化功能. 酶的催化效率
紫外分光光度法测定蔗糖含量
从试验结果可见该方法具有很好的选择性和较 高的灵敏度 ,适用于各种饮料中的蔗糖含量测定 。
(下转第 365 页)
·363 ·
夏岫云 : ED TA 滴定法测定稀土镁硅铁中氧化镁
本文选择重铬酸钾溶液溶解样品 。 2. 2 溶样时间的确定
蔗糖在盐酸介质中发生水解产生果糖和葡萄 糖 ,果糖在盐酸的作用下生成羟甲基糠醛[6] ,通过对 产物的吸收光谱进行扫描 ,发现在 291 nm 波长处 有最大吸收 。蔗糖浓度在0～50 mg ·L - 1 范围内服 从比耳定律 。本法只加入盐酸 ,不加入其它显色物 质 ,样品无需预处理 ,方法简便 、快速 、灵敏 ,无污染 。
1 试验部分
1. 1 试剂与仪器 蔗糖标准溶液 : 0. 200 0 g ·L - 1 ,称取蔗糖 (分
析纯试剂) 01 200 0 g 溶于二次蒸馏水 ,并定容到 1 L。
TU21201 紫外可见分光光度计 水为二次蒸馏水 1. 2 试验方法 在具塞比色管中加入适量的 0. 200 0 g ·L - 1 蔗 糖标准溶液 , 加入浓盐酸 3 mL , 用二次水定容至 10 mL 。在沸水中加热 8 min ,取出用流水冷却. 用 1 cm 比色皿 ,以试剂空白为参比 ,于 291 nm 波长处 测定其吸光度 。
按试验方法进行了干扰试验 ,结果表明 ,维生素 C 、柠檬酸 、2 g ·L - 1 苯甲酸钠对测定没有干扰 。 2. 6 工作曲线的绘制
吸取 0. 200 0 g ·L - 1 蔗糖标准溶液 0. 0 ,0. 5 , 1. 0 ,1. 5 ,2. 0 ,2. 5 mL ,按试验方法测定吸光度 ,绘 制工作曲线 ,蔗糖含量在 0～50 mg ·L - 1 范围内服 从比耳定律 ,线性方程 A = 0. 016 4 c + 0. 009 6 ,相 关系数为 0. 998 4 。对 40 mg ·L - 1 蔗糖进行 11 次 测定 ,相对标准偏差为 2. 6 %。 2. 7 样品分析
旋光度法测定蔗糖酶促蔗糖转化反应的米氏常数实验数据处理讲述
蔗糖α0标准浓度曲线c α0 矫正0.5013 22.95 22.890.2506 11.45 11.390.2005 9.50 9.440.1253 5.80 5.740.1002 4.95 4.890.0000 0.05 -0.01α∞标准浓度曲线c α∞矫正0.5 -5.46 -5.40.25 -2.46 -2.40.2 -1.81 -1.75 0.125 -1.36 -1.30.1 -0.96 -0.90 -0.01 0.05Θ~T 图BAA AB B Statistics StatisticsValue StandardErrorValue Standard Error Reduced Chi-Sqr Adj. R-Square578.354 85 424.1007924.81417 308.50034 1287.37815 0.80259Θ~T图BAA AB B Statistics StatisticsValue StandardErrorValueStandardErrorReduced Chi-Sqr Adj. R-Square-587.30141 283.40519 765.6761 181.24833 1801.60554 0.92183BAA AB B Statistics StatisticsValue Standard Error Value Standard Error Reduced Chi-SqrAdj.R-Square 771.78924116.94457188.2675653.426015456.259530.95808Θ~T图BAA AB B Statistics StatisticsValue StandardErrorValueStandardErrorReducedChi-SqrAdj.R-Square854.30527 59.46159 266.47343 26.06065 1790.00858 0.99181Θ~T 图BAA AB B Statistics StatisticsValueStandardError ValueStandard Error Reduced Chi-SqrAdj.R-Square1169.03818 51.86019 391.31523 19.46767 2461.855330.99593BAA AB B Statistics StatisticsValue StandardErrorValueStandardErrorReducedChi-SqrAdj.R-Square-2000.83841 882.92013 2821.95907 637.57974 6875.2044 0.96368S0 A B S0/RO R00.05 578.35485 24.81417 603.16902 8.28955E-050.06 -587.30141 765.6761 178.37469 0.0003363710.08 771.78924 188.26756 960.0568 8.33284E-050.10 854.30527 266.47343 1120.7787 8.92237E-050.15 1169.03818 391.31523 1560.35341 9.61321E-050.30 -2000.83841 2821.95907 821.12066 0.000365354Hanes-Woolf法得截距纵坐标截距KM/rM=167.02KM=0.01774mol/L3rM=1.063*10^(-4)mol/L3【思考题】1、1、有文献指出，蔗糖转化反应的产物果糖可能对蔗糖酶产生竞争抑制作用，而葡萄糖可能产生非竞争抑制作用。
生化实验讲义：实验九 酵母蔗糖酶(最后)
实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。
蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖222酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
两种酶的性质对照表如下：实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。
比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
本实验共有九个分实验：一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反应时间对产物形成的影响五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K m和最大反应速度V max的测定八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
酵母蔗糖酶K_m值的测定
刘 玲 钟才云 王颖明 莫宝庆 赵 岩 谢慧文
南京医科大学营养与食品卫生学教研室, 南京 210029
关键词 多糖类; 香菇; 黄芪; 生物学效应
复合多糖是从黄芪和香菇中提取出的多糖制品, 我们对 复合多糖进行了抗疲劳和抗辐射作用的研究, 为多糖的生理 活性提供了新的依据。
呈色, 用普通大试管已能满足要求, 无需用血糖管。 ④减少了 2 3 的试剂用量。 在此基础上我们对醇母
释度, 分别求出 4 个管中的还原糖的毫克数, 以相应 管生成还原糖的毫克数的倒数为纵坐标, 以底物浓
蔗糖酶 Km 值的测定方法重新设计。 113 测定方法
度 (蔗糖的浓度) 倒数为横坐标, 作酵母蔗糖酶的 Km 值, 其中 1 号管的点飘, 远离曲线; ②底物液仅有 4
参考文献
3 讨 论
图 1 酵母蔗糖酶的 Km 值
1 黄如彬 1 生物化学实验教程 1 第 2 版 1 北京: 世界图书 出版公司, 19981112～ 114
2 南京大学生物系 1 生物化学实验 1 第 1 版 1 北京: 人民 教育出版社, 197914～ 6 (1998212230 收稿)
Km 为米氏常数 (M icha llis2M en ten) 是当酶促反
应速度为最大速度一半时的底物浓度。1 Km 值可用 来 表示对底物的亲和力。 酶与底物亲和力大, 则 1 Km 大, 即 Km 值小, 表示在底物浓度很低时就可以 达到最大反应速度的一半。 从上面的结果我们可以 用原实验设计与改进后的酵母蔗糖酶 Km 值的测定 进行比较。①原设计底物液为 4 个稀释度, 改进后增 加到 6 个稀释度, 提高了作图求 Km 值的准确性。② 原设计中 1 号管点飘。因为 1 号管稀释度大, 溶液颜 色浅, 比色时读数过低, 超出了比色机的灵敏度, 所 以读数不易准确。改进后的设计解决了这个问题。③ 原设计中试剂用量大 (是改进前的 3 倍) , 并且要用 血糖管做, 改进后大大地减少了试剂用量, 用普通大 试管就可以完成实验。这样既达到实验要求, 又降低 了成本。
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数是衡量酶与底物结合能力的指标之一。
下面是米氏
常数测定实验的报告：
实验目的：
通过测定酶的反应速率，确定酶的米氏常数。
实验原理：
酶促反应遵循米氏-明可夫斯基动力学（Michaelis-Menten kinetics）的规律，即将底物浓度作为独立变量，反应速率作为因变量，建立数
学模型。
该模型表达式为：
V0=Vmax×[S]÷(Km+[S])
其中，V0为反应速率，Vmax为最大反应速率，[S]为底物浓度，Km为
米氏常数。
实验步骤：
1.准备100mmol/L的底物溶液和酶液
2.取不同浓度的底物溶液，加入相同量的酶液，并在恒温水浴中反应
一定时间
3.反应结束后，停止反应，加入酶抑制剂终止反应
4.用滤纸过滤液体，取滤液用于分光光度计测定吸光度
5.将吸光度转换为底物浓度，并绘制底物浓度-V0曲线
6.通过线性回归计算得到Km值
实验结果：
假设底物的浓度为[S]，V0为反应速率，则上述式子可以改写为：
1/V0=(Km/Vmax)×(1/[S])+1/Vmax
将1/V0作为y轴，1/[S]作为x轴，绘制出图像，得到斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax。
通过线性回归计算得到Km为10mmol/L，Vmax为5μmol/L·min。
实验结论：
通过实验测定，得到该酶的米氏常数为10mmol/L，最大反应速率为
5μmol/L·min。
这表明该酶与底物的结合能力相对较强，但反应速率并不是特别快。
酵母蔗糖酶Km值的测定(精)
酵母蔗糖酶Km值的测定
目的与要求：
学习米氏常数的测定原理及方法， 认识底物浓度对酶促反应速度的影响。
实验原理：
影响酶促反应速度的因素有：底物浓度、酶的浓
度、pH值、环境温度等。当环境温度、pH值和酶浓 度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓 度增大而增大，直到酶全部被底物所饱和时达到最 大速度Vmax。反应初速度与底物浓度间的关系可用 米-曼氏方程式表示。将两边取倒数，采用双倒数作 图法可求得Km值。
操作步骤
干净大试管5只编号,按 P45表加入试剂.混匀,37
C15min.
取出后加入1mol/L NaOH 0.5ml,摇匀终止反应。 按 P45表加入试剂.混匀,沸水浴5min,流水冷却，
稀释到12.5ml.
540nm测 OD值。
结果与计算：
在横坐标上查得酵母蔗糖酶的Km值。
注意事项：
酶催化蔗糖转化 实验报告
根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：
85
0
0.035
100
-0.083
0.036
由上表，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线：
由上图可看出，在反应的前一段时间内，反应速率保持不变，随着反应的进行，反应速率逐渐减小，趋紧于0.下降的原因是由于底物浓度的降低、酶在一定pH及温度下部分失活、产物对酶的抑制、产物浓度的增加而加速了逆反应的进行等。
y6028x其中x蔗糖转化成葡萄糖的浓度my蔗糖转化进程中体系的旋光度值不同浓度蔗糖溶液的旋光度值其值可以测定也可以通过下式计666lcl10cmc是蔗糖浓度gml通过上述的直线方程可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值求出其转化成葡萄糖的浓度x从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度
酶催化蔗糖转化反应
用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。
五、数据处理
1．利用(3)中的数据计算酶的比活性。
起始旋光度
结束旋光度
葡萄糖浓度
生成葡萄糖的毫克数
1.859
1.762
0.001609mol/L
24.638mg
由 比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)，可得：
溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度与反应物浓度C成线形关系，即
酵母蔗糖酶Km值的测定
酵母蔗糖酶Km值的测定原理当环境温度，pH和酶浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物的浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱合时达到最大速度Vmax。
反应初速度与底物浓度之间的关系，经米-曼（Michaelis-Menten）二氏推导其关系可用下式表示。
式是Km称为米氏常数。
相当于反应速度为最大速度一半（v = ）时的底物浓度。
Km是酶的特征性常数：测定Km值是研究酶的动力学的一项重要内容。
但由于米-曼氏方程式中v与[S]的关系为双曲线的一支，用作图法求Km 值不方便，林-贝（Lineweaver-Burk）二氏将上式变形，利用与的直线关系作图，即本实验以酵母蔗糖酶为例学习一种简单的Km值测定法。
酵母蔗糖在30℃，pH4.6苹果酸缓冲液中的Km值为9.1×10-3mol/L。
本实验用从酵母中提取的蔗糖酶粗制品在pH5.0的醋酸缓冲液中作测定，将等量的蔗糖酶与不同浓度的蔗糖混合，在规定的反应时间后，加入Folin-吴血糖测定用的碱性铜试剂，利用碱性铜盐终止酶促反应，然后用Folin-吴血糖测定法测定蔗糖在反应时间内被酶催化水解生成的葡萄糖和果糖量。
葡萄糖和果糖均可与碱性铜试剂作用，铜离子被还原为氧化亚铜，生成的氧化亚铜可使磷钼酸试剂中的Mo6+还原为钼兰，利用钼兰作比色，还原糖的生成量用作代表反应开始阶段的初速度。
按林-贝二氏作图法，可从X轴上的截距求得Km。
实验前对酶的活性（也就是酶的浓度）需经预实验调节：按实验规定的条件用最浓的蔗糖浓度（第1管），作预实验所得的钼兰比色液吸光度应调节在0.6-0.8之间，如因酶活性过大，在规定的反应时间内底物分解过快浓度降低很快，所测得的数值将与反应初速度相差甚远，即测得的Km值将不能代表真实情况。
如酶活性过低，吸光度读数将偏低，又会受Folin-吴血糖测定法灵敏度的限制。
三、器材1．15×150mm试管及试管架2．5ml吸管、2ml吸管、1ml吸管、0.5ml 吸管3．水浴器材4．72-1型分光光度计四、试剂1．0.03mol/L经纯化的蔗糖溶液，若蔗糖不纯，需要利用蔗糖、葡萄糖和果糖在乙醇中溶解度的不同，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。
酵母蔗糖酶米氏常数的测定
酵母蔗糖酶米氏常数的测定[原理]当环境的温度、pH 和酶浓度等条件恒定时，酶促反应的初速度V 随底物的浓度[S]增高而加快，直至达到一极限，即最大反应速度Vmax 。
根据底物浓度和反应速度的这种关系，Michaelis-Menten 推导得出如下公式：式中Km 为米氏常数。
它是酶的特征性常数。
测定Km 是研究酶的一项重要工作。
大多数酶Km 在10-3～10-5mol/L 左右。
但是Michaelis-Menten 方程中反应速度V 与底物浓度[S]之间为双曲线关系，通过作图求Km 值极不方便。
Lineweaver-Burk 根据米氏方程又推导出如下直线方程：以1/[S]为横坐标，1/V 为纵坐标，将各点连成一直线，此线向左延长与横轴相交处即为米氏常数（Km ）的负值。
本实验是用比色法测定一定时间内、一定量的蔗糖酶作用于不同浓度的底物（蔗糖）生成产物的量，即葡萄糖的量。
此产物的生成量为反应速度，然后按Lineweaver-Burk 双倒数作图法作图（图14），就可以求出Km 值。
图14 Lineweaver-Burk 双倒数作图法[试剂]1．0.03mol/L 蔗糖溶液。
2．0.2mol/L pH5.0醋酸缓冲液：取0.2mol/L 醋酸钠溶液70ml 与0.2mol/L 乙酸溶液V =Vmax [S] Km +[S]1 V = · 1 Vmax 1 [S] + Km Vmax1 [S] 1 Km30ml相混合。
3．蔗糖酶溶液：干酵母2.5g置研钵中，加蒸馏水4ml，用力研磨10分钟，转移到离心管中，用25ml蒸馏水洗研钵，并将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置50分钟，离心（2000r/min 5min），小心取出上清夜备用。
置冰箱保存。
实验时根据需要用蒸馏水适当稀释。
（约25倍稀释）4．碱性硫酸铜溶液：取无水Na2CO340g溶于400ml蒸馏水中；酒石酸7.5g溶于350ml 蒸馏水中；结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O）4.5g溶于200ml蒸馏水中，以上分别加热促溶。
酵母蔗糖酶Km值的测定
酵母蔗糖酶Km值的测定原理当环境温度，pH和酶浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物的浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱合时达到最大速度Vmax。
反应初速度与底物浓度之间的关系，经米-曼（Michaelis-Menten）二氏推导其关系可用下式表示。
式是Km称为米氏常数。
相当于反应速度为最大速度一半（v = ）时的底物浓度。
Km是酶的特征性常数：测定Km值是研究酶的动力学的一项重要内容。
但由于米-曼氏方程式中v与[S]的关系为双曲线的一支，用作图法求Km 值不方便，林-贝（Lineweaver-Burk）二氏将上式变形，利用与的直线关系作图，即本实验以酵母蔗糖酶为例学习一种简单的Km值测定法。
酵母蔗糖在30℃，pH4.6苹果酸缓冲液中的Km值为9.1×10-3mol/L。
本实验用从酵母中提取的蔗糖酶粗制品在pH5.0的醋酸缓冲液中作测定，将等量的蔗糖酶与不同浓度的蔗糖混合，在规定的反应时间后，加入Folin-吴血糖测定用的碱性铜试剂，利用碱性铜盐终止酶促反应，然后用Folin-吴血糖测定法测定蔗糖在反应时间内被酶催化水解生成的葡萄糖和果糖量。
葡萄糖和果糖均可与碱性铜试剂作用，铜离子被还原为氧化亚铜，生成的氧化亚铜可使磷钼酸试剂中的Mo6+还原为钼兰，利用钼兰作比色，还原糖的生成量用作代表反应开始阶段的初速度。
按林-贝二氏作图法，可从X轴上的截距求得Km。
实验前对酶的活性（也就是酶的浓度）需经预实验调节：按实验规定的条件用最浓的蔗糖浓度（第1管），作预实验所得的钼兰比色液吸光度应调节在0.6-0.8之间，如因酶活性过大，在规定的反应时间内底物分解过快浓度降低很快，所测得的数值将与反应初速度相差甚远，即测得的Km值将不能代表真实情况。
如酶活性过低，吸光度读数将偏低，又会受Folin-吴血糖测定法灵敏度的限制。
三、器材1．15×150mm试管及试管架2．5ml吸管、2ml吸管、1ml吸管、0.5ml 吸管3．水浴器材4．72-1型分光光度计四、试剂1．0.03mol/L经纯化的蔗糖溶液，若蔗糖不纯，需要利用蔗糖、葡萄糖和果糖在乙醇中溶解度的不同，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。
酶催化蔗糖转化 实验报告
根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：
2.736
2.585
0.0024994
0.0004999
0.0041656
6
18.0
0.15
0.0513
3.420
3.255
0.0027302
0.0005460
0.0036403
7
21.6
0.18
0.0616
4.103
3.986
0.0019491
0.0003898
0.0021657
8
25.2
0.21
用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。
五、数据处理
1．利用(3)中的数据计算酶的比活性。
起始旋光度
结束旋光度
葡萄糖浓度
生成葡萄糖的毫克数
1.859
1.762
0.001609mol/L
24.638mg
由 比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)，可得：
y＝－60.28x＋
其中x－蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）
y－蔗糖转化进程中体系的旋光度值
－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。
＝66.6×L×C（L＝10cm，C是蔗糖浓度g/mL）
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实验报告解析
（目的要求、基本原理、仪器试剂和实验步骤四个部分可参阅实验预习或者实验内容部分，数据处理部分参见数据处理）
一、实验重点
1、掌握本实验的基本原理。
2、掌握实验中用到仪器的操作方法，并能熟练使用。
3、了解实验中的注意事项并能解释为什么。
二、实验难点
1、葡萄糖标准曲线的绘制
2、反应实验条件的控制
三、注意事项
1、分光光度计使用注意事项：
(1)使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。
(2)仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。
(3)如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。
(4)仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。
(5)当仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器
2、葡萄糖标准曲线的绘制要精确
3、反应条件要严格安要求控制
四、思考题回答
1、为什么说米氏常数是一个特征性常数，而且最大反应速度不是？
米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。
米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。
Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。
它的意义如下：它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。
它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。
它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。
限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。
它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。
Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。
但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。
2、为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？
米氏方程式是根据中间产物理论推导出来的。
即在酶催化反应中，酶（E）和底物（S）首先生成中间产物（ES），然后分解成产物（P）和游离酶（E）：
（1）
、、代表反应各步的速率常数。
当反应以恒态进行时，ES的生成速率等于分解速率，即
（2）
式中、和分别代表酶、底物和中间产物的浓度。
令
（3）
设反应前酶的初始浓度为,则
（4）
由（3）和（4）式得：
（5）
当酶的浓度一定时，测定的是底物反应的初速率，那么由S P 的反应速率为，但在反应方程式（1）中，ES的分解速率很慢，这一步成了总反应的决定步骤，则有
（6）
在反应开始阶段，底物浓度的增加，反应速率也随着增加；当增加到过剩时，进一步增加不再影响反应速率了，即达到。
此时绝大部分酶与底物都结合了。
可近似地看作,则有：
因此测定酶的米氏常数要采用初始速率法。
3、试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系。
米氏常数的测定结果准确与否与酶的活性有莫大的关联而酶是一种活性蛋白质，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性，
同时也影响着米氏常数的测定。
酶与底物作用的活性，受温度、pH 值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
(一) 温度
酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。
酶的作用速度与温度的关系为：当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右。
通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。
(二) pH值
pH值可改变底物的带电状态，从而影响底物分子与酶的结合。
各种酶的特异性表明，酶的活动中心只能结合带某种电荷的离子，包括正电、负电或两性电荷。
酶分子具有两性电解质的性质，同时pH 值也改变了酶分子的带电状态，特别是改变了酶活力中心上有关基团的电离状态。
当在某一pH时，酶分子的活动中心，既存在一个带正电的基团，又存在一个带负电的基团，这时，酶与底物结合最容易；当pH偏高或偏低时，其活动中心只带有一种电荷，就会使酶与底物的结合能力降低。
例如，蔗糖酶当处于等电点时，才具有酶活性，而在等电点的偏酸或偏碱的一侧，酶活性则降低甚至完全丧失。
(三) 酶的浓度和底物浓度
酶与底物浓度的关系，一般来说，当酶的浓度较小，底物浓度大大高于酶，则酶的浓度与反应速度成正比；当底物浓度一定时，酶的浓度继续增加到一定值以后，其反应速度并不加快。