分离膜蛋白的方法

分离膜蛋白的方法有两种：1先分离膜，然后提取；2用特殊的去污剂选择性的分离。第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。

原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。

方案

1）放射性标记受试细胞

2）将标记的细胞放在冰上

3）去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

4）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min

5)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心

6）溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min

7)收集水相留作分析

8）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心

9）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

10）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂

2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)

3)buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)