毕业论文抗菌肽

蚯蚓抗菌肽的提取及其活性检测

摘要：采用不同的硫酸铵溶液沉淀蚯蚓粗蛋白，来探究硫酸铵浓度对蚯蚓蛋白质抗菌活性的影响；用不同pH的磷酸缓冲液处理蚯蚓粗蛋白沉淀来探究pH对其活性的影响；以及采用稀释法测量蚯蚓抗菌肽达到抑菌效果的最高稀释度。研究表明，80%硫酸铵沉淀的蚯蚓粗蛋白提取液的抑菌效果最好；pH为中性及近中性更易于蚯蚓抗菌肽保持其活性；蚯蚓抗菌肽对G+的抑菌效果比对G-的好。关键词：蚯蚓;抗菌肽;硫酸铵沉淀;抗菌活性

Abstract：in order to explore the effect of the different concentrations of ammonium sulfate on the antibacterial activity of Earthworms protein.so they were extracted by different saturation degree of ammonium sulfate .And we can explore crude protein，s antimicrobial peptide activity of earthworm with a buffer phosphoric acid solution of different pH,and measure the highest dilution of antimicrobial peptides of earthworm to inhibit the growth of bacterial using dilution.Studies have shown that earthworm，s crude protein extracted buy the 80% ammonium sulfate precipitation has the best inhibitory effect,neutral or nearly neutral pH is better for the activity of the earthworm，s antimicrobial peptides,and its inhibitory effect to G+ is better than G-. Keywords: earthworm; antibacterial peptides; precipitating in ammonium sulfate; antibacterial activity

0引言

蚯蚓是营腐生生活动物，以腐败的有机物为食，生活充满了大量微生物的潮湿环境中却极少得病，这得益于蚯蚓体内独特的抗菌免疫系统[1]。其中体液免疫很发达，这得益于抗菌肽在其中发挥的重要作用。抗菌肽（Anti-bacterial peptides）是一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是在诱导的条件下动物免疫防御系统产生的，也是动物免疫防御系统的重要组成部分[2]。随着对抗菌肽研究的深入，人们发现抗菌肽在动植物和微生物中广泛分布，这些小分子量的多肽抗菌谱广，还可以抗真菌，抗病毒，抗肿瘤，且不易产生抗药性[3]。

国外最早的对蚯蚓抗菌肽的研究是从1985年开始的，Vaillier等人通过国凝胶过滤、色谱聚焦、抑菌活性测定，从蚯蚓的体腔液中提取出了3种活性蛋白，

它们均表现出较强的抗菌作用，并且具有红细胞凝聚和溶血的性质，分子量分别为20000Da，40000Da，45000Da，等电点分别为4.9，5.75，6.0[4]。国内直到1995年才有对于蚯蚓抗菌肽的研究报道。林少琴等[5]将蚯蚓粗提取物用DEAE-SepharoseFF层析柱分离纯化得到3种蛋白，并且通过对各组分进行的抗肿瘤研究，发现其对H22腹水瘤的抑制作用较明显。

目前，在两栖类动物、昆虫、哺乳动物和甲壳类动物中都可以分离出抗菌肽，在鱼类和线虫中也有一些发现。但与其他动物相比蚯蚓来源广，便于养殖，易于处理，为蚯蚓抗菌肽的广泛使用提供了条件。而且蚯蚓抗菌肽主要存在于体腔液中，含量相对较高。因此利用蚯蚓抗菌肽易于诱导的特性，进行蚯蚓抗菌肽的直接提取利用，例如其作为抗生素饲料添加剂代替品，可以有效地防止病原微生物的侵袭，减少药物的耐受性以及药物在人体和动物体残留的问题。因此蚯蚓抗菌肽的研究不仅可行性强，而且具有广阔的前景。

1材料与方法

1．1 材料

蚯蚓：野生蚯蚓；

菌种：圣女果洗脱液中分离的菌种

试剂：浓度为50%，60%，70%，80%的饱和硫酸铵溶液

PBS缓冲液：每升Nacl 8g；Kcl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g，pH=4.5，6.0，7.5，9.0 ，4℃预冷

LB固体培养基：每升胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，琼脂粉15g，pH=7.4 LB液体培养基：每升胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl，10g，pH=7.4

器材：小烧杯，大烧杯，玻璃棒，剪刀，组织匀浆机，离心管，低温离心机，滴管，电子天平，电磁炉，量筒，容量瓶，锥形瓶，pH试纸，酒精灯，培养皿，接种环，涂布玻棒，移液枪，枪头，滤纸片，冰箱，高压蒸汽灭菌器，恒温培养箱，超净工作台，滤纸，打孔器，酒精棉球

1．2方法

1.2.1蚯蚓抗菌肽粗提液的提取

将10g鲜活的蚯蚓水中浸泡24 h，吐出肠道中的泥土。PBS (pH6.0)清洗干净后，剪取组织后加入 2 倍体积的4 ℃预冷的PBS 溶液，充分研磨，4 ℃

离心，2000 r/min，离心15 min，取上清液。取4个15ml离心管分别加入6ml 上清液并分别缓慢加入等体积的50%，60%，70%，80% 的硫酸铵溶液，混匀后4 ℃静置4 h，7000r/min，离心15 min，留取沉淀，将沉淀溶于上述缓冲液中1.2.2纯菌悬液的制备

将圣女果洗脱液涂布于LB固体培养基上，37℃恒温箱中培养24小时，取两种单菌落分别涂布于不同的LB固体培养基平板上，37℃恒温箱中培养24小时，分别挑去单菌落接种于两个装有20mlLB液体培养基的锥形瓶中，37℃摇瓶培养8h，获得纯菌悬液。

1.2.3涂布法检测蚯蚓抗菌肽的抑菌活性

取纯菌液适量涂布于LB固体培养基上，用无菌滤纸片蘸取蚯蚓抗菌肽粗提液贴于平板上，37℃恒温培养12h后观察抑菌圈有无及其大小，并记录结果。

1.2.4 pH对蚯蚓抗菌肽活性的影响的检测

用蚯蚓抗菌肽抑菌效果最好的硫酸铵浓度以同样方法重新提取蚯蚓粗蛋白于不同pH的磷酸缓冲液，重复步骤3。

1.2.5蚯蚓抗菌肽活性的定量检测

将蚯蚓抗菌肽粗提取液进行2倍递减梯度稀释，即稀释液的稀释倍数分别为2、4、8、16、32倍。分别取其稀释液100 μL，加到微量稀释板的加样孔中，然后取100 μL从圣女果洗脱液中分离得到的A，B纯菌液(菌液浓度为106 mL-1)接种于其中，混匀后，37 ℃恒温箱振荡培养24 h。如有混浊，即表明菌已生长，该稀释度抗菌肽无抗菌作用，以完全无菌生长的最高抗菌肽稀释度度作为该菌对该抗菌肽的最高抑菌稀释度[6]

2结果与分析

2．1不同浓度硫酸铵沉淀的蚯蚓抗菌肽粗提液的抑菌现象