中药生物效应指纹图谱构建新思路——与微流控芯片技术的结合

·中药谱效关系研究·
中药生物效应指纹图谱构建新思路 —— 与微流控芯片技术的结合
史志兵, 蔡民民, 李建新*
南京大学化学化工学院, 南京 210093
【摘 要】 随着中药分析手段和信息技术的发展, 基于中药化学成分的指纹图谱技术已成为中药质量控制的重
要手段之一, 但如何更好地快速分析化学指纹图谱, 并将其与生物效应指纹图谱在线结合在一定程度上较全面地反
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互作用, 一般检测的分子的相对分子质量都在数千 左右。随着仪器设备的发展、实验方法的改进以及 数据处理手段的进步, 使得小分子(MWt <500 Da) 的 检 测 成 为 了可能[16], 最新的仪器每天可以分析 100~400 个样品。
传感芯片是 SPR 的核心组件, 传感芯片提供了 产生 SPR 信号的必需物理条件, 分子相互作用的研 究是在传感芯片表面进行的。一般首先将所要研究 的酶或蛋白质以合适的方式固定于芯片表面, 当含 有被分析小分子的载流缓冲液(被 LC 分离的化合物) 通过微流通道到达流通池与酶或蛋白质接触结合 时, 芯片表面基质的折射率增加, 导致共振信号上 升, 经过一系列的计算, 就能够得出结合速率常数 或解离速率常数。最后通入再生溶液(高盐、酸性或 碱性溶液等), 以破坏配体–受体结合, 使芯片再生, 进行下一个分析, 最后得到生物效应指纹图谱。图 3 显示了利用 SPR 检测通过 HPLC 分离得到的各个 峰的生物活性的理想装置。该装置的关键点是如何 合理地除去 HPLC 中的有机溶媒, 将化合物溶于合 适的载流缓冲液中, LC-NMR 可以给出一定的参考。
映中药质量仍然是中药现代化研究的关键科学问题。本文简单介绍了 LC-MS 和 LC-NMR 技术解析化学指纹图谱、
微流控芯片技术在生物效应检测中的应用, 分析了将微流控芯片技术与化学成分的指纹图谱技术相结合的可能性,
希望对我国中药质量研究起到推动和促进作用。
【关键词】 中药质量控制; 微流控芯片; 生物效应图谱; 化学指纹图谱
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图 4 浓度梯度装置及细胞培养微流控芯片 (据 Anal Chem, 2009, 81: 7075-7080 修改)
朱俊杰等与作者设计了一种利用量子点的药 物活性检测和快速筛选微流控芯片(图 4)[20]。利用 上游的浓度梯度装置调节药物浓度, 通过沙袋拦坝 捕获固定癌细胞, 检测了环己酰亚胺、依托泊苷和 喜树碱的活性。同时利用量子点 Annexin V 检测 细胞凋亡。结果与传统培养法相比, 量子点检测药物 孵育时间从 1 h 降到 5 min, 可以迅速进行药物筛选。
化学指纹图谱进行全面的在线分析[15]。 在明确化学指纹主要成分结构的基础上, 如果
能够在线检测这些分子的生物效应, 实现化学指纹 与生物效应指纹的耦合, 将有助于解决中药质量评 价中存在的关键问题, 极大地提高中药质量控制的 可靠性。微流控芯片系统, 经过十几年的发展, 已 经成为 21 世纪最为重要的前沿技术之一, 现已广 泛应用于生命科学、环境监测、食品分析等领域， 与传统检测方法相比, 具有高灵敏、高通量、样品 和试剂耗量小等优点。
图 2 E. vogelii 的二氯甲烷提取物 On-flow LC–NMR 图 (据 J Chromatogr A, 2002, 974: 123-134 修改)
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同样, 多通道微流控芯片也可以用于生物效应 指纹图谱的建立[19]。
3 基于微流控芯片的在线细胞效应检测
细胞作为生物有机体结构和功能的基本单位,
其生物学功能多样复杂。药物研发和化合物的生物 活性检测, 常常使用细胞培养系统。由于微流控芯 片的微通道宽度(10~50 μm)和生物细胞大小相当, 随着生命科学的飞速发展, 利用微流控芯片系统对 细胞、单细胞或细胞内的成分和形态变化进行分析 和检测已成为研究的热点。而且生物细胞在微通道 内容易操纵、观察和检测, 利用微流控芯片进行细 胞培养生物活性研究具有独特的优越性。
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但是由于中药成分的复杂性, 目前大部分的报 道只是给出图谱, 对化学指纹图谱中每一个或大部 分信号峰所表示的成分的结构难以解析确认。所幸 的是 LC-MS 和 LC-NMR 技术给中药化学指纹图谱 的分析提供了根本的解决办法。同样生物活性检测 常常使用如酶、细胞等手段, 使得单一的基于化学 反应的检测手段难以应对生物效应形式的多样性。 另外由于色谱分离得到每个峰所含的化学成分非 常少, 如何实现对酶及细胞水平的生物活性在线分 析面临挑战。
本文对使用 LC-MS 和 LC-NMR 分析化学指纹 图谱, 微流控芯片与色谱分离实现在线生物效应检 测的思路、技术的可能性及关键问题进行分析, 期 待能在获得化学指纹图谱详细信息的基础上, 为实 现化学与生物效应指纹图谱的在线整合提供新的 思路, 为中药质量评价提供新的方法学。
1 基于 LC-MS 和 LC-NMR 技术的化学指纹 图谱的在线全面分析
【中图分类号】 R917
【文献标识号】 A 【文章编号】1672-3651(2010)03-0162-05
doi: 10.3724/SP. J. 1009.2010.00162
单一中药(天然药物)其成分众多,即使是相同 的中药，受气候、土壤、生态环境等因素及不同产 地、不同采收季节或加工方法不同的影响, 其化学 成分会有一定的区别[1]。尤其是中医一般使用中药 复方, 其成分就更为复杂, 但是质量控制是药物的 最基本要求之一。随着中药分析手段和信息技术的 发展, 基于色谱技术及化学成分的“中药指纹图谱 技术”已成为中药质量控制的重要手段[2-3]。该技术 能较为全面地反映中药所含的化学物质群, 以确保 产品质量的稳定性。指纹图谱技术对推动中药现代 化的发展, 促进中药农业的产业化, 提高中药原料 质量作出了重要的贡献。但是“中药指纹图谱技术” 研究的是中药主要化学成分, 只是反映中药的化学 成分信息, 各化学成分量的多少有时很难与活性的 强弱有直接的关系。因此化学指纹图谱技术孤立于 生物效应之外, 没有涉及到与生物效应相关的有效 成分, 即中药药效物质基础。毫无疑问，分离获取 化学指纹图谱中的每个成分, 测试其生物效应, 可 以很好地反映中药的质量, 但是需要相当的人力、 物力和财力。理想的技术是在中药药效化学物质复
图 1 基于 LC-UV/MS 及 LC-NMR 的色谱峰成分结构 分析 (据 J Chromatogra A, 2003, 1000: 437-455 修改)
Queiroz 等利用 LC-MSn 和 LC-1H NMR 的 on-flow 方式对刺桐属植物 Erythrina vogelii (Leguminosae) 的提取物 HPLC 中的主要峰进行了 分析, 结果高效准确地鉴定了所表示成分的结构 (图 2), 揭示了利用 LC-MS 和 LC-NMR 技术可以对
如上所述, 目前中药的化学指纹图谱有一大部 分只是给出一个色谱峰的集成, 缺乏对主要色谱峰 所表示的成分的分析。如果能够实现对化学指纹图
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谱大部分峰所表示成分的明确解析, 将会极大地提 高图谱的价值和功能。勿庸置疑, 解决该问题, 使 用对中药提取物的成分进行分离、结构鉴定的常规 研究方法效率过低甚至无法有效地发挥作用。由于 常用中药的主要化学成分已经基本分析清楚, 结合 UV 或 DAD 图谱, 利用成熟的高效灵敏的分析方法 — 液 相 质 谱 联 用 LC-MS 或 多 级 质 谱 联 用 LC-MSn 技术, 对色谱峰所表示的成分结构进行推 测表征已经不是非常困难(图 1)。由于现在结构表 征最常用的有力手段为 NMR, 因此 LC-NMR 在鉴 定结构尤其是具有相同骨架的同类化合物, 鉴别新 组分结构类型,以及在化合物的快速鉴定筛除等方 面显示了不可替代的作用。因此 LC-NMR 作为上 述 LC-MS 技术的补充, 如果能够实现优势互补, 至 少可实现化学指纹图谱的主要色谱峰的结构分 析[13-14]。
杂的背景下, 利用色谱或其他分离手段, 将其 化学组成进行快速分离, 同时实现生物效应活性 (online)检测的耦合,即在获取化学指纹图谱的同时 得到与化学指纹相对应的生物效应指纹图谱, 以评 价中药的质量。因此, 如何在建立能够较好地反映 中药中化学物质组成方法的同时, 又能了解相关化 学物质的生物效应, 从而达到较为全面控制中药整 体物质群, 评价中药质量和研究中药复方, 已成为 中药研究的热点之一。
微流控芯片(microfluidic chip) 或称微全分析 系统 (micro total analysis system, μTAS)是将采 样、预处理、加试剂、反应、分离和检测等集成在 微芯片上进行的一门新技术。该技术具有体积小、 操作简单、样品用量少、分析速度快、操作易自动化 等优点[10], 不仅可以实施化学分离, 而且能够进行酶 及细胞的分析[11-12]。微流控芯片近几年来发展极其迅 速, 也为实现中药生物效应的在线分析提供了机会。
2 基于 SPR 传感芯片的在线酶/蛋白质效应 检测
表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一种物理光学现象。该技术两个最明显的 优势是实时检测和无需标记, 同时具有分析快捷、 灵敏度高、前处理简单、样品用量少等优点, 已被 广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食 品安全和环境监测等领域, 并且显示出广阔的应用 前景。SPR 技术最初用于检测生物大分子之间的相
图 3 LC-SPR 装置示意图
利用 SPR 研究小分子与酶相互作用有不少报 道。Kampranis 等研究了香豆素以及 cyclothialidine 药物(MWt < 700 Da)和野生突变型 DNA 旋转酶结 合的动力学[17]。这些高亲合势的药物－蛋白相互作 用(KD = （1-150） nmol·L−1)显示了旋转酶上的哪 些残基是对药物结合有作用的。与之相反, Strandh 等论证了对低亲合势的检测(KD ~1 mmol·L−1), 研 究了 saccharides (MWt < 800 Da)和抗体的相互作用 [18]。SPR 技术能够检测强和弱结合的能力, 使得这 种技术在生物效应指纹图谱分析中有特别的意义。