纳豆激酶活性测定
中国纳豆激酶团体标准
中国纳豆激酶团体标准一、纳豆激酶的活性定义和测量方法纳豆激酶是一种从纳豆中提取的酶，具有溶解血栓、降低血液粘稠度等作用。
纳豆激酶的活性是指其在一定时间内分解纤维蛋白的能力，通常以单位表示。
测量纳豆激酶活性的方法有多种，常用的有纤维蛋白平板法、光谱法等。
二、纳豆激酶原料的要求和检测标准纳豆激酶原料应符合以下要求：1.来源：应来自经过严格筛选的纳豆发酵原料，确保无污染、无有害微生物和有害化学物质。
2.活性：原料中纳豆激酶的活性应达到一定标准，如不得低于10000单位/克。
3.稳定性：原料应具有良好的稳定性，确保在生产、储存和使用过程中不易失去活性。
纳豆激酶原料的检测标准包括：1.外观：应呈均匀的黄色或淡黄色，无杂质。
2.气味：应具有典型的纳豆气味，无异味。
3.水分：水分含量应符合规定，以保证原料的稳定性。
4.活性：按照规定的测量方法进行检测，确保达到规定的活性标准。
三、纳豆激酶产品的生产规范和流程纳豆激酶产品的生产应遵循以下规范和流程：1.原料准备：按照规定的标准筛选原料，并进行必要的清洗和干燥处理。
2.提取和纯化：采用适当的提取和纯化技术，如离心、过滤、沉淀等，以获得高纯度的纳豆激酶。
3.制剂制备：将纳豆激酶与其他必要的辅料混合，制备成各种剂型的纳豆激酶产品，如片剂、胶囊、口服液等。
4.质量检测：对每个生产批次的产品进行质量检测，确保符合规定的标准。
5.包装和储存：按照规定的包装要求进行包装，并确保产品在适当的温度和湿度条件下储存。
6.运输：在运输过程中，应采取必要的措施防止产品损坏和污染。
四、纳豆激酶产品的质量控制和安全性评估纳豆激酶产品的质量控制是确保产品质量和安全的关键环节，应遵循以下要求：1.质量标准：制定详细的质量标准，包括性状、鉴别、纯度、活性等方面的规定。
2.质量检验：对每个生产批次的产品进行质量检验，确保符合质量标准。
3.不合格品处理：对不合格品进行标识、记录并按照规定进行处理，防止不合格品流入市场。
纳豆激酶的活性测定
纳豆激酶的活性测定
胡静
【期刊名称】《海峡药学》
【年(卷),期】2013(025)005
【摘要】建立快速、简单测定纳豆激酶活性的方法.本实验以TAME为底物测定纳豆激酶的效价,根据扫描发现蓝色复合物在574nm处有最大吸收,故在574nm处测定吸收度,依照公式,TAME(u·mL-1)=(甲醇微克分子数×样品稀释倍数)/(样品量mL×时间min),计算样品的TAME单位.结果 TAME法灵敏度高,操作简便,适合作为常规的分析检测手段.结论实验证明,TAME法能准确测定纳豆激酶的活性,且设计简单,操作方便,重现性好,是一个切实可行的测定纳豆激酶的方法.
【总页数】2页(P47-48)
【作者】胡静
【作者单位】浙江省宁波市李惠利医院,宁波,315040
【正文语种】中文
【中图分类】Q55
【相关文献】
1.纳豆冻干粉中纳豆激酶的活性测定 [J], 敖宇涛;王冬雪;许灵善;聂风环;王玮;郭建鹏
2.两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析 [J], 杨明俊;杨晓彤;冯慧琴;糜可;杨庆尧
3.纳豆激酶体外活性测定及影响因素考察 [J], 王怡鑫;尹宗宁;张霞
4.纳豆激酶分离纯化和酶活性测定的研究进展 [J], 法芸;张金玲;赵海杰;刘会洲
5.纳豆激酶活性测定方法和膳食用量 [J], 刘艳春; 蔡凌云; 王秀伶; 窦世娟
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纳豆激酶酶活测定方法
纳豆激酶酶活测定方法琼脂糖—纤维素平板法：（1）原理：在血液中纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白原往往处于结合状态，因此本试验所用纤维蛋白原制剂均包含纤维蛋白溶酶原。
用凝血酶将纤维蛋白原凝结成蛋白平板后，将样品定量滴在平板上，如果有纤维蛋白溶酶原激活剂活性存在，将纤维蛋白溶酶原激活成纤维蛋白溶酶，从而溶解纤维蛋白，出现溶圈。
在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，溶圈的大小反映了激活剂的量。
（2）仪器：玻璃平皿（直径12cm）10ul微量进样器变温电炉（1000W）恒温培养箱（±0.5℃）超净工作台游标卡尺电脑扫描仪（3）试剂药品：1、0.1M磷酸盐缓冲液：0.1M磷酸氢二钠：取无水磷酸氢二钠14.2克用蒸馏水稀释到1000毫升。
0.1M磷酸二氢钠：取无水磷酸二氢钠2.4克用蒸馏水稀释到200毫升。
两种溶液按一定比例混合，用ＰＨ计测定PH至7.4。
2、尿激酶溶液：尿激酶标准品用磷酸盐缓冲液分别配成每毫升磷酸盐缓冲液含10、20、40、60国际单位溶液（中国药品生物检定所尿激酶标准品）。
3、纤维蛋白原溶液：取一只纤维蛋白原加磷酸盐缓冲液32毫升（中国药品生物检定所牛血纤维蛋白原，每支可凝蛋白77毫克）。
4、凝血酶溶液：配成每毫升磷酸盐缓冲液含25单位凝血酶溶液（中国药品生物检定所凝血酶）。
5、琼脂糖溶液：0.1克琼脂糖（电泳级）加磷酸盐缓冲液40毫升，煮沸加炭素墨水1至2滴，至体积约30毫升，取20毫升。
6、样品溶液：样品提取液用水配成每毫升含相当于10—60单位尿激酶的溶液。
（4）测定方法：在超净工作台上将20毫升琼脂糖溶液加15毫升纤维蛋白原溶液，在40℃左右混合，立即加凝血酶0.5毫升混匀，倒入平皿（表面不得有气泡）。
盖盖静置30分钟，用微量进样器分别吸标准品及样品溶液10微升，针刺入平板底垂直点样。
置于37℃恒温培养箱中16小时，取出。
数据处理方法1：用游标卡尺量出每个溶圈相互垂直的两直径，以两直径乘积为横坐标，标准品浓度为纵坐标在双对数纸上作标准曲线，从标准曲线上查出样品单位数。
纳豆激酶活性测定方法
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该 方 法 的 优 点 是 ， 可 以 同 时 测 多 个 样 品 ， 而 且 在 可 对 酶 活 性 进 行 测 定 ， 操 作 简 便 、 快 捷 ， 样 品 消 4h 内 耗 小 ， 成 本 低 。 另 外 ， " 的 变 异 系 数 CV% 在 OD655 值 内 ， 可 信 度 高 。 5% 以 应 注 意 的 一 点 是 ， 人 工 血 栓 的 制 作 对 消 光 值 的 测 定 是 有 影 响 的 。 不 过 如 果 反 应 开 始 时 小 孔 内 的 血 栓 的 吸 光 值 在 O . 2 以 上 ， 那 么 人 工 血 栓 的 调 制 对 几 乎 没 有 太 大 的 影 响 。 OD655 值 5
［ 将 其 作 为 预 防 和 治 疗 心 血 管 疾 病 的 药 品 l］ 。 l987 年 ［ 溶 纤 维 活 性 9］ 。 用 溶 解 面 积 来 表 示 NK 的
在 培 养 皿 中 加 入 血 纤 维 蛋 白 原 （ fibrinOgGn） 溶 液 和 凝 血 酶 溶 液 ， 搅 拌 使 其 凝 固 制 成 平 板 。 取 不 同 浓 度 品 点 于 平 板 上 ， 恒 温 孵 育 测 其 溶 解 NK 样 37C l8h， 圈 直 径 。 可 以 发 现 酶 量 与 溶 解 面 积 成 直 线 关 系 。 以 标 准 纤 溶 酶 （ PIasimin） 作 为 标 准 NK 或 UK 或 品 作 标 准 曲 线 。 活 性 单 位 定 义 为 ： 在 37C lmin NK 的 内 分 解 解 于 酸 缓 冲 溶 液 （ pH7 . l nmOI 溶 0 . lmOI / L 磷 中 的 浓 度 4） 5 x l0 - 4 mOI / L 的 H-D-VaI-LGu-Lys-pNA 的 为 或 者 以 UK 或 纤 溶 酶 的 活 性 单 位 来 表 NK 量 lU。 示 。 维 溶 解 面 积 来 表 示 活 性 ， 完 全 是 表 观 值 。 如 恒 温 孵 育 时 间 变 化 ， NK 的 测 定 值 的 变 化 很 大 。 随 着 恒 温 时 间 的 增 加 ， 所 对 应 的 值 显 著 减 少 。 比 之 制 产 品 ， 粗 制 酶 活 性 测 定 NK 精 受 孵 育 时 间 影 响 更 大 ， 这 可 能 是 粗 酶 中 杂 质 的 影 响 。
纳豆激酶活性测定方法和膳食用量
Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2020, 9(2), 132-136Published Online May 2020 in Hans. /journal/hjfnshttps:///10.12677/hjfns.2020.92017Methods for Assay of Nattokinase Activityand the Dosage of DietaryYanchun Liu, Lingyun Cai, Xiuling Wang, Shijuan Dou*College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding HebeiReceived: Mar. 17th, 2020; accepted: Apr. 2nd, 2020; published: Apr. 9th, 2020AbstractNatto, which is a must-have food in Japan, has a long history and a unique flavor. Natto has various functions, among which the thrombolytic effect of nattokinase has attracted much attention. A lot of methods have been used to assay the activity of nattokinase. The article summarizes five main methods, including fibrin plate method, fibrin degradation method, casein degradation method, synthetic substrate method and enzyme-linked immunoassay. At present, fibrin plate method and fibrin degradation method are being used commonly. By comparing different methods for assay-ing nattokinase activity, we hope that the assay method can be unified and a uniform standard for dietary dosage of natto produced by different companies can be put forward.KeywordsNatto, Nattokinase, Methods of Nattokinase Activity, Dosage of Dietary纳豆激酶活性测定方法和膳食用量刘艳春，蔡凌云，王秀伶，窦世娟*河北农业大学，生命科学学院，河北保定收稿日期：2020年3月17日；录用日期：2020年4月2日；发布日期：2020年4月9日摘要纳豆历史悠久，风味独特，在日本已成餐桌必备食品。
纳豆激酶
纳豆知识纳豆（natto），学名枯草菌。
日本传统的做法是把煮熟的大豆趁热装在用纳豆菌做成的稻草器皿里，利用稻草上附着的纳豆菌自然发酵而做成的。
用这种方法做成的纳豆中，除了纳豆菌以外，还含有其他杂菌，不仅卫生不过关，而且质量也不好。
1980年的一天，正在美国芝加哥罗宾斯研究所从事血栓研究工作的日本须见洋行教授在比较230多种食品后，赫然发现仅有纳豆菌食品含高浓度的血栓溶解成份。
他将脑血栓患者常服用的溶血栓药物放在定量的人造血栓上，结果耗费一个晚上的时间才能完全溶解，而以同样方法换上一粒纳豆菌食品则只需3小时便可完成。
纳豆激酶，可直接分解血栓，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600IU。
纳豆激酶对血栓的作用时间长达8-12小时，而尿激酶作用时间只有30分钟。
尿激酶只能注射，纳豆激酶即可注射也可口服，而且可以在毛细血管中发挥作用。
纳豆在日本已食用1000年，是一种安全的食用血栓预防剂。
纳豆和纳豆激酶的生产工艺纳豆的生产过程：精选小粒黄豆→清洗→蒸煮→沥干→降温至恒温→接种→低温培养→分装→冷冻保存→纳豆纳豆是日本的传统食品，是选用优质黄豆经纳豆菌生物发酵而成。
纳豆的外表带有一层白霜，用筷子搅拌时，会拉出粘丝，拉丝越多越好。
这些拉丝所含有的成份大都就是纳豆激酶。
现在市场上销售的纳豆产品因为保存期过长失去大部分功效或者价格过高，所以目前最行之有效的办法就是用科技提取制作，这个技术目前国有只有上海顶舜颖生物科技有限公司所掌握和运用。
这样制作才能满足人体每天2000FU以上的需求。
一、使用器皿和材料①大豆500g②纳豆菌种5g③高压锅④不锈钢盆⑤泡沫饭盒等浅容器⑥泡沫箱子⑦2立升长方形塑胶瓶子或暖水袋⑧温度计二、泡豆蒸豆将大豆充分洗净后，加入3倍量的水浸泡一夜后，倒掉水放进高压锅内蒸到大豆用手捏碎的程度，大约45分钟。
如没有高压锅，煮水时一次不要放得太多。
为了保持大豆的原汁原味，最好是蒸。
三、接种纳豆菌将纳豆菌种用50ml热水（温度最好38-45℃，温度太高会杀死纳豆菌）溶解后，均匀地加入到热大豆中（温度最好38-45℃，温度太高会杀死纳豆菌），迅速搅拌均匀，分装在7个泡沫饭盒里，厚度大约2cm，上面苫上纱布或者在饭盒与饭盒盖之间架上一双筷子，使其充分接触空气。
纳豆激酶酶活检测
纳豆激酶(NattoKinase, NK)酶活检测1）生理盐水：0.9% NaCl蒸馏水溶解配制称取3.6g NaCl，加入蒸馏水400mL，振荡即可溶解，溶液为无色透明状2）PBS：0.01mol/L 磷酸缓冲溶液配制方法：①A液（0.01mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·2H2O 1.56g，溶于蒸馏水中，定容1000mL。
②B液（0.01mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O 2.68g （或Na2HPO4·12H2O 3.58g 或Na2HPO4·2H2O 1.78g）加蒸馏水溶解，并定容至1000mL。
③pH=7.2磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液的配制上述两种溶液均无色透明，按照体积比2∶1混合Na2HPO4与NaH2PO4，所得PBS 溶液pH值为7.8。
在28.0mL A 液中，加入72.0mL B 液，为0.01mol/L PBS 溶液。
3）工作溶液：将0.01mol/L 磷酸缓冲液和生理盐水按照1：17 的体积比例配制即可。
PBS∶生理盐水=1∶174）琼脂糖：1.5%，工作溶液溶解配制称取0.75g琼脂糖粉，加入50mL工作溶液，混匀，微波炉内中低火力加热1min，使琼脂糖充分溶解，溶液呈完全流动、透明状态，将琼脂糖溶液放置在55℃水浴保温。
5）凝血酶：10U/mL，生理盐水溶解配制将1000U 凝血酶溶于1mL 超纯去离子水中，震荡混匀，用移液枪取100μL用0.9%生理盐水配制成10U/mL，于-20℃条件下保存一个月，仍可使用。
6）纤维蛋白原：0.15%，工作溶液①纤维蛋白原试管短暂离心，量取66.7mL工作溶液，将纤维蛋白原粉倒入工作溶液，可观察到，纤维蛋白原为干粉，容易倒出。
②最初，纤维蛋白原粉漂浮在溶液上面，轻轻振荡，纤维蛋白原粉分散下沉，可明显看到悬浮小碎片，室温放置数分钟，可观察到悬浮小碎片明显减少。
纳豆激酶活性检验分析
納豆激酶活性檢驗分析納豆激酶(nattokinase, subtilisin NAT)是由納豆菌(Bacillus subtilis natto)生產的一種蛋白質分解酵素，對於血纖維蛋白（fibrin）具有專一性的分解能力。
此酵素首次由Sumi Y.於1987年發現（Experientia, Oct 15; 43(10):1110-1），後經分析此酵素為具有27,7 kD分子量、275 個氨基酸組成的蛋白質，並於1992年由Ichishima E. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992; 56:1869–1871)確認此酵素的基因序列。
雖然納豆已是日本國內相當普遍的食品，但將納豆菌所生產的納豆激酶進行純化，而成為食品的形式，無論中外均需要建立在食品安全的考量上。
近年來尋找血纖維蛋白分解酵素的相關的研究蓬勃地發展，的確也發現在非納豆菌的微生物中，可以找到具有分解血纖維蛋白能力的酵素，但這些酵素無法被稱為納豆激酶，更重要的是這些物質在開發成食品原料或商品前，是否可提供正確的納豆激酶活性檢測依據以及經過完整的食用安全性評估。
針對納豆激酶其對於血纖維蛋白分解的專一性，進行活性分析，目前在台灣並未有公定之分析方法。
日本對於納豆激酶相關食品的規格標示，包括：「日本ナットウキナーゼ協会(日本納豆激酶協會)」及「財団法人日本健康・栄養食品協会(財團法人日本健康營養食品協會)」等單位進行認證，而此二單位對於納豆激酶的活性檢測，是以評估對血纖維蛋白之分解能力，而訂定活性單位：FU（fibrin degradation unit）；即1 FU定義為：在275 nm的波長下，每0.01分鐘可使1毫升反應溶液中之吸光値增加1，所具有的酵素活性能力。
嘉義大學生命科學院「中草藥暨微生物利用研發中心」致力於協助國內廠商針對中草藥及微生物等生產之活性物質進行開發及研究。
自成立以來，已建立國內許多中草藥之成分分析及鑑定方法，提供廠商進行產品開發時之關鍵性依據。
纳豆激酶的提取、提纯程序
纳豆激酶的提取、提纯程序及活性测定孙雪天津工业生物技术研究所2013E8018261011由于我们实验室较少做酶的分离提纯，所以我选择了自己比较感兴趣的一种酶——纳豆激酶。
选择此酶的理由：人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心脑血管疾病，对中老年人的身体健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者约1 500 万人，潜在的溶栓剂市场有20 亿美元[1]。
但当前的溶栓剂，如尿激酶( SK) 和链激酶(UK) ，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂，存在着价格高的缺点等，难以成为适用于大众的药品。
而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点[2] ，市场前景极为诱人。
［3］纳豆激酶(Nattokinase , N K; 也称Subtilisin NAT ,Subtilisin BSP) 是由纳豆菌( Bacill us subtilis var. nat to) 产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶( Subtilisin)，属于水解酶类，催化蛋白质的水解。
现在可以由分离纯化的纳豆激酶DNA 序列推出其氨基酸序列,根据该顺序计算出该酶的分子量为27 728 u[4 ]，远小于尿激酶的分子量54 000 u。
用Svunsson柱型电泳法等电聚焦测得纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其p I 值为8. 6 ±0. 3。
[5 ]提取提纯程序：纳豆激酶是胞外酶［6］，故可利用纳豆菌的发酵液提取，省去了细胞破碎和缓冲液抽提的步骤。
具体方法如下［7］：（1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4 000 rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。
（2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。
取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。
纳豆激酶活性测定相关明
納豆激酶活性測定相關說明1.測定方式:依納豆激酶測定法-Fibrin分解法(同日本納豆激酶協會及日本食品衛生協會之測定法)測定其活性，並利用納豆激酶標準品的活性來做為樣品活性的校正。
2.委託方式:(不接受以個人名義委託)請見附件-納豆激酶活性測試委託書 (下頁)3.收件方式:請郵寄至600嘉義市鹿寮里學府路300號國立嘉義大學微生物與免疫學系謝佳雯老師實驗室 A25-203 收4.檢驗工作天數:以申請回覆函為依據，預估自收件日後一個月內檢測完成。
每月15日前收件，15日後收件一律以隔月樣品計算。
5.收費標準:97年1月1日起，每一樣品檢測費用新台幣9000元整。
6.付費方式:檢驗費用請以郵局匯票、即期支票 (抬頭請寫全銜 ＂國立嘉義大學＂) 或現金寄至600嘉義市鹿寮里學府路300號，收件單位為『國立嘉義大學 生命科學院附設檢驗分析及技術推廣服務中心收』，待收到款項後，會立即將檢驗報告及收據正本寄至貴公司。
7.聯絡方式:□ 國立嘉義大學生命科學院檢驗分析暨技術推廣服務中心(05)2717611‧2717622 洽詢檢測申請事項□ 中草葯暨微生物利用研發中心 (05)2717802 洽詢檢測進度事項8.附註:＊ 樣品按申請順序處理，其完成日期視物品性質需要訂定之。
原則上，在收到樣品30日內(不包括收樣日)完成檢驗。
＊ 委託者如有特殊需要，得於委託檢驗時，提出申請速件處理，惟需加收檢驗費用（普通件價錢之1.5倍）。
＊ 工作天不包括週六、週日及國定例假日。
＊ 出具中文報告一式兩份，若有其他要求請另外告知。
附件-納豆激酶活性測試委託書一、 公司名稱: 公司地址:□□□□□ 聯絡人: 電話: Fax: E-mail: 檢測樣品種類:產品批號:製造日期:保存期限:□ 食品 (至少50克)□ 軟/硬膠囊 (至少5克；10顆/粒) 總重: g/顆；殼重: g/顆； 內容物重: g/顆□ 納豆激酶原料 (至少10克) □ 其他 樣品數量:(為避免保存過程造成檢測誤差，建議提供樣品不可為散裝樣品。
纳豆激酶活力测定
纳豆激酶检测操作程序1-1）.制作生理盐水缓冲液准备鹏酸和鹏酸钠。
鹏酸属酸性，鹏酸钠属碱性。
制作0.5ml的鹏酸生理盐水和0.5ml的鹏酸钠生理盐水。
将ph值调整到7.8。
1-2).加入纤维蛋白原准备纤维蛋白原。
将纤维蛋白原以0.4%的比例添加到已准备好的缓冲液中。
此时必须注意的是0.4%的添加比例。
纤维蛋白原没有100%的纯品。
0.4%是纯品的换算值。
一般在标签上会标明浓度。
如果浓度为50%，则纤维蛋白原按0.8%的比例添加；如果浓度为80%，则纤维蛋白原按0.5%的比例添加。
1-3）.制作牛凝血酶溶液准备牛凝血酶将50U的牛凝血酶放入1ml的生理盐水中溶解1-4）.制作plate将（1-2）中所做的缓冲液10ml注入玻璃容器中。
再将已制成的牛凝血酶0.5ml注入容器，搅拌凝固。
这一步的操作手法如果不好的话，在均匀地混合搅拌以前就会凝固。
另外，搅拌中如果混入杂质也不容易溶解。
（注：在容器中操作如果有困难的话，可以在试管中混合、搅拌；或是在废弃的注射器中混合、搅拌）2－1）incubate制作纳豆激酶溶液。
如果仅仅只是测试有无活性，则浓度多少随意。
如果是以鸟激酶为指标作对比实验，则需严格控制浓度。
纳豆激酶溶液每10μl 测定点位。
spotting后的容器在37度常温下incubate（使用孵化器也可）2-2)测定面积纤维蛋白在溶解后会形成圆形物。
在2小时以后、4小时以后、24小时以后测量圆的面积。
纳豆激酶的研究进展陈志文徐尔尼肖美燕Study on NattokinaseCHEN Zhi Wen XU Er－ ni XIAO Mei－ yanAbstract: Compared with some traditional thrombolytics,nattokinase,which is found to be a strong fibrinolytic enzyme,is safer and lower－ cost.It is effective by oral administration,andexpected to be a new thrombolytics.Its isolation、 purification and characteristics are introduced in this paper. The newly studies on its activity detection、 stability factors and high output are alse summed in this paper.Key words:nattokinase,activity detection,stability factors,high output摘要：纳豆激酶有很强的溶血栓能力，跟传统的一些溶栓剂相比，具有安全性好、成本低、口服有效等优点，极有可能开发为新一代的溶栓剂。
两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析
作者简介：杨明俊（１９７９－），男（汉），硕士研究生，研究方向：微生物药物学。
＊通讯作者杨明俊１，杨晓彤１，＊，冯慧琴１，糜可１，杨庆尧２（１．上海师范大学微生物与免疫学研究所，上海２００２３４；２．上海杨杨百草研究所，上海２００２３４）两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析摘要：从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较研究，并验证了两种方法测定值之间的直线相关性。
结果表明：纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ浓度范围内呈线性，且日间和日内变异系数均小于１０％。
两者结果具有直线相关性，其关系为纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）。
结论：纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于纳豆激酶活性测定，前者测定结果直接，但四肽底物法更灵敏，还可应用于高通量筛选。
关键词：纳豆激酶；纤维蛋白平板法；四肽底物法ＡＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＡＮＤＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳＴＵＤＹＯＦＴＷＯＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＡＴＴＯＫＩＮＡＳＥＡＣＴＩＶＩＴＹＤＥＴＥＣＴＩＯＮＹＡＮＧＭｉｎｇ－ｊｕｎ１，ＹＡＮＧＸｉａｏ－ｔｏｎｇ１，＊，ＦＥＮＧＨｕｉ－ｑｉｎ１，ＭＩＫｅ１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ－ｙａｏ２（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｈａｎｇｈａｉＹａｎｇ’ｓＨｅｒｂＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅ（ＦＰ）ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｕｌｔｓ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｙｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅ－ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｓｗｅｒｅ１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬｆｏｒＦＰｍｅｔｈｏｄａｎｄ０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬｆｏｒＳＳｍｅｔｈｏｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｂｏｔｈＣＶｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｉｎｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙａｎｄｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｔｗｏｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄａｓ：ＦＰｖａｌｕｅｓ（ＩＵ）＝２６４．８７×ＳＳｖａｌｕｅｓ（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ：ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄａｒｅｂｏｔｈａｐ－ｐｌｉｃａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍＦＰｍｅｔｈｏｄｃａｎｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｆｌｅｃｔｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ’ｓｔｈｒｏｍ－ｂｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｆｏｒｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ；ｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ纳豆（Ｎａｔｔｏ）是日本的传统发酵食品，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｎａｔｔｏ）发酵而成，其风味独特、营养丰富。
琼脂糖—纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性
琼脂糖—纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行测定，在检测酶浓度单位在2000～10000U/ml时呈现很好的2次曲线关系，蚓激酶浓度单位-两垂直直径的乘积回归方程为y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相关系数r2=0.9993。
本法回收率范围在89.53%～100.75%，平均回收率为94.7%，RSD为4.2%。
Abstract：The activities of Nattokinase（NK）in natto freeze-dried powder was assessed by agar-fibrin plate assay，it displays a good quadratic relations under the enzyme concentration of 0.30%～0.40%.The product of the regression equation between concentration of vermis kinase and two vertical diameter was y=-0.0000004839x2+0.02203-12.2715，The correlation coefficient was 0.9993.The recovery of the method was found to be in the range of 89.53%-100.75%，the average recovery was 94.7%，RSD=4.2%。
Key words：Agarose；Fibrin；Nattokinase；Lumbrokinase；Plate method纳豆（Natto）是，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis var.natto）发酵而成。
纳豆激酶活性测定方法和膳食用量
Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2020, 9(2), 132-136Published Online May 2020 in Hans. /journal/hjfnshttps:///10.12677/hjfns.2020.92017Methods for Assay of Nattokinase Activityand the Dosage of DietaryYanchun Liu, Lingyun Cai, Xiuling Wang, Shijuan Dou*College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding HebeiReceived: Mar. 17th, 2020; accepted: Apr. 2nd, 2020; published: Apr. 9th, 2020AbstractNatto, which is a must-have food in Japan, has a long history and a unique flavor. Natto has various functions, among which the thrombolytic effect of nattokinase has attracted much attention. A lot of methods have been used to assay the activity of nattokinase. The article summarizes five main methods, including fibrin plate method, fibrin degradation method, casein degradation method, synthetic substrate method and enzyme-linked immunoassay. At present, fibrin plate method and fibrin degradation method are being used commonly. By comparing different methods for assay-ing nattokinase activity, we hope that the assay method can be unified and a uniform standard for dietary dosage of natto produced by different companies can be put forward.KeywordsNatto, Nattokinase, Methods of Nattokinase Activity, Dosage of Dietary纳豆激酶活性测定方法和膳食用量刘艳春，蔡凌云，王秀伶，窦世娟*河北农业大学，生命科学学院，河北保定收稿日期：2020年3月17日；录用日期：2020年4月2日；发布日期：2020年4月9日摘要纳豆历史悠久，风味独特，在日本已成餐桌必备食品。
纳豆冻干粉中纳豆激酶的活性测定
ＡＯ Ｙｕ — ｔ ａ ｏ 。 ， Ｗ ＡＮＧ Ｄｏ ｎ ｇ — ｘ ｕ ｅ ， ＸＵ Ｌ ｉ ｎ ｇ — ｓ ｈ ａ ｎ ， ＮＩ Ｅ Ｆ ｅ ｎ ｇ － ｈ ｕ ａ ｎ ， Ｗ ＡＮＧ Ｗｅ ｉ ， ＧＵＯ Ｊ ｉ ａ ｎ － ｐ ｅ ｎ ｇ 。
（ Ｊ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ， Ｙ ａ ｎ ｂ ｉ ａ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｙ ａ ｎ ｊ ｉ Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ １ ３ ３ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
食ห้องสมุดไป่ตู้
品 与 发 酵 科 技
Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ＆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
第５ ２卷 （ 第 ６期 ） Ｖ ｏ １ ． ５ ２ ， Ｎｏ ． ６
纳 豆 冻 干 粉 中纳 豆激 酶 的 活性 测定
ｃ ｒ ｕ ｄ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｏ ｆ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｎ ａ ｔ ｏｋ ｔ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ．
２ ． Ｙ ａ ｎ ｂ ｉ ａ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｈ ｅ ｒ ｂ ａ ｇ ｅ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ． ， Ｌ ｔ ｄ ． ， Ｌ ｏ ｎ ｇｉ ｎ ｇ Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ １ ３ ３ ４ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ａ） ｎ
关键 词 ： 纳豆 ； 冻干 粉 ； Ｔ Ａ ＭＥ 中 图分 类 号 ： ２ ０ ７ ． ３ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ６ ７ ４ — ５ ０ ６ Ｘ（ ２ ０ １ ６ ） ０ ６ — ０ ０ ９ ６ — ０ ０ ０ ３
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纳豆激酶检测方法
目前行业内流行的纳豆激酶检测大致有三种方法，其原理、利弊简介如下：
一、 IU纤维蛋白平板法：
以尿激酶为对照，与纳豆激酶样品同时在纤维蛋白平板特定条件下所形成水解圈，测量各自水解圈直径，通过计算取得相应纳豆激酶活力。
由于对水解圈直径的认定的认定存在经验人员视觉差异，导致测定粗放，数据波动性强，重复性差，不具权威依据。
二、 FU紫外分光法：
纳豆激酶与纤维蛋白在一定条件下作用会产生可溶性低分子物质，通过紫外分光技术检测其浓度，通过计算取得相应纳豆激酶活力，数据稳定，重复性强。
测定硬件条件苛刻，测定成本高，不具权威性依据。
三、 U中性蛋白酶法：
纳豆激酶与酪蛋白在一定条件下作用会产生可溶性低分子物质，通过普通比色计检测其浓度，计算取得相应纳豆激酶活力，数据稳定，重复性强。
测定简单，检测成本低，有国家标准为依据。
1）琼脂糖一纤维蛋白平板法是，是目前最常用的纤溶酶溶栓活力测定方法，此法的原理是用琼脂糖作为固体支持，以凝血酶和纤维蛋白
原制做人工血栓平板，注入NK，用溶解圈垂直直径的乘积(mm2)表示纤溶活力，以标准UK或纤溶酶为标准品作标准曲线，计算出NK的活性相当于标准品的单位数。
此法简便易行，并可同时测定多个样品，但由于溶解圈面积受恒温反应时间的影响很大，所以对恒温时间的控制十分重要，且恒温时间对粗制酶活性测定的影响比对NK精制产品活性测定的影响大。
2）在直径15mm的硅化试管中依次加入pH值为7.7的咪唑缓冲液、纳豆激酶收集液、凝血酶和纤维蛋白原，立即振摇数秒，使之产生絮状物，置38℃水浴30 min，置冰水中终止反应。
用100目尼龙网过滤试管中未溶解的纤维蛋白，滤纸吸干，用蒸馏水漂洗，再用滤纸吸干，放入小试管中，再加3mL浓度为O．2 mol/L的NaOH溶液，在沸水中煮15min，冷却。
用分光光度计测定溶液在280nm处的吸光值，并根据活力计算公式计算纤溶活力。
纳豆激酶活力=
A对照−A样
0.5ml×30min
×3×1000ug。