纳豆激酶酶活测定方法

纳豆激酶酶活测定方法

琼脂糖—纤维素平板法：

（1）原理：

在血液中纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白原往往处于结合状态，因此本试验所用纤维蛋白原制剂均包含纤维蛋白溶酶原。用凝血酶将纤维蛋白原凝结成蛋白平板后，将样品定量滴在平板上，如果有纤维蛋白溶酶原激活剂活性存在，将纤维蛋白溶酶原激活成纤维蛋白溶酶，从而溶解纤维蛋白，出现溶圈。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，溶圈的大小反映了激活剂的量。

（2）仪器：玻璃平皿（直径12cm）10ul微量进样器变温电炉（1000W）恒温培养箱（±0.5℃）超净工作台游标卡尺电脑扫描仪

（3）试剂药品：

1、0.1M磷酸盐缓冲液：

0.1M磷酸氢二钠：取无水磷酸氢二钠14.2克用蒸馏水稀释到1000毫升。

0.1M磷酸二氢钠：取无水磷酸二氢钠2.4克用蒸馏水稀释到200毫升。

两种溶液按一定比例混合，用ＰＨ计测定PH至7.4。

2、尿激酶溶液：尿激酶标准品用磷酸盐缓冲液分别配成每毫升磷酸盐缓冲液含10、20、40、60国际单位溶液（中国药品生物检定所尿激酶标准品）。

3、纤维蛋白原溶液：取一只纤维蛋白原加磷酸盐缓冲液32毫升（中国药品生物检定所牛血纤维蛋白原，每支可凝蛋白77毫克）。

4、凝血酶溶液：配成每毫升磷酸盐缓冲液含25单位凝血酶溶液（中国药品生物检定所凝血酶）。

5、琼脂糖溶液：0.1克琼脂糖（电泳级）加磷酸盐缓冲液40毫升，煮沸加炭素墨水1至2滴，至体积约30毫升，取20毫升。

6、样品溶液：样品提取液用水配成每毫升含相当于10—60单位尿激酶的溶液。

（4）测定方法：

在超净工作台上将20毫升琼脂糖溶液加15毫升纤维蛋白原溶液，在40℃左右混合，立即加凝血酶0.5毫升混匀，倒入平皿（表面不得有气泡）。盖盖静

置30分钟，用微量进样器分别吸标准品及样品溶液10微升，针刺入平板底垂直点样。置于37℃恒温培养箱中16小时，取出。

数据处理方法1：用游标卡尺量出每个溶圈相互垂直的两直径，以两直径乘积为横坐标，标准品浓度为纵坐标在双对数纸上作标准曲线，从标准曲线上查出样品单位数。

数据处理方法2：用扫描仪在相同位置，300dpi分辨率，彩色模式下扫描平板图片（平板口向上，上衬黑板纸），保存。用Phototshop软件打开图片，调整图片对比度、亮度，使溶圈边缘最清楚，图片放大3倍，选定“标尺”显示，单位为“厘米”。通过“信息”分别读取溶圈横纵向垂直四点数值，计算出溶圈两直径。以两直径乘积对数为横坐标，标准品浓度对数为纵坐标在Office Excel上做图表标准曲线，通过标准曲线图表公式计算，反对数求出样品单位数。