酶活性测定方法
酶活性测定的方法
酶活性测定的方法
1. 分光光度法：利用酶反应所产生的光学变化，测定吸光度的变化来推断酶活性的大小。
2. 电化学法：利用酶催化反应产生的电化学反应，测定电流的变化来推断酶活性的大小。
3. 比色法：利用酶反应所产生的还原物或氧化物使某一与之相应的指示剂发生颜色变化，来推断酶活性的大小。
4. 管道法：将酶溶液、底物和指示剂分装在不同的细管内，然后加入底物的初始剂量使反应开始，观察指示剂的变化时间来推断酶活性的大小。
5. 放射性测定法：利用放射性同位素标记底物或产物，测定其放射性的变化来推断酶活性的大小。
4.1酶活性测定有哪些方法
③由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以 大大地扩展(无需S、P间有特性差异)
④除上述两法外还有其他一些方法：平衡法
平衡法（又称终点法）
通过测定酶反应开始至反应达到平衡时 产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方 法。
谢 谢！
优点：动态了解反应v,易区分零级和一级反应期及延滞期 缺点：a.测定时需保温
b.检测有限制：△被测物S与P间理化特性要有差异 △显色剂对酶活性无影响
保温装置
注意：
①连续监测法测定包括了: 延滞期、线性期、非线性期(动态期)v 平衡期v
动态定量描述：早期称动态法
②速度计算;
a.线性期，初v符合米氏方程的变量关系
定时法可能引起的误差
A.两点间呈线性（少见） B.线性期短，大部分
为非线性(最常见) C.包括了延滞期 D.包括延滞期和非线性部分
∵测定不够准确，
实际测得平均v 结果偏低
定时法可能引起的误差示义图
[P]
A
D
C
B
t0
t
t
连续监测法：
定义：连续 (间隔15”~1’)测定酶反应过程中某一反应产物 或底物浓度随时间的变化来求酶反应初速度的方 法 — 动力学方法, 速率法
非线性期v不能简单地按米氏方程的计算它是表观速度vapp或称反应净速度存在逆反应实际酶测定时的时间进程曲线图表观速度vappor称反应净速度vms常数kss常数由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以大大地扩展无需sp间有特性差异除上述两法外还有其他一些方法
酶活性测定有哪些方法
Progress curve of a typical enzyme reaction
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用P E塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100m L 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100m g 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
食品中酶活性的测定方法与作用评价
食品中酶活性的测定方法与作用评价食品中的酶活性是指食品中含有的酶的活性水平。
酶是一种能够加速化学反应速率的蛋白质分子，它们在生物体内起着至关重要的作用。
在食品中，酶的活性对于食品的品质、储存和加工都有着深远的影响。
因此，准确测定食品中的酶活性，并评价其对食品的作用，对于食品工业及消费者来说都具有重要意义。
目前，常见的测定食品中酶活性的方法主要有两种，分别是酶动力学法和酶质谱分析法。
酶动力学法通过测定酶催化反应速率的变化来间接测定酶的活性。
首先，确定反应所需的底物和酶的适宜浓度，然后通过改变反应体系中底物或酶的浓度，观察反应速率的变化。
利用这种方法，可以推算出酶的催化反应速率常数和底物的最大转化速率。
最常用的是Michaelis-Menten动力学方程和Lineweaver-Burk双倒数图法。
酶动力学法可以测定食品中多种酶的活性，并通过调整酶活性来改善食品的加工性和品质。
酶质谱分析法则是通过质谱仪的技术手段直接测定酶的活性。
质谱仪是一种能够测定物质分子质量的仪器，通过将食品样品中的酶分子离子化，并根据其质量比例进行分离和测定。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以在食品中快速、准确地确定酶的活性水平，但由于设备复杂和价格昂贵，应用较为有限。
无论使用何种方法进行酶活性的测定，评价酶在食品中的作用都是至关重要的。
首先，酶活性的测定可以评价食品的新鲜度。
以水果为例，水果中的酶在成熟过程中发挥着重要的作用。
通过测定水果中的酶活性，可以了解水果的成熟程度和品质。
当果实成熟时，酶的活性会降低，从而导致果肉变软、变甜。
相反，当果实过度成熟或腐烂时，酶活性将会增加，导致果肉褐变和气味恶化。
因此，通过监测酶活性可以及时评估水果的新鲜度，对于确定最佳食用时机具有重要意义。
其次，酶活性的测定可以评价食品的加工品质。
食品加工过程中，酶常常被用于提高食品的口感和质感。
以面包为例，加入面团中的面包酵母能够产生酶来催化面团中的淀粉转化为糖，从而使面包更加松软和香甜。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶的测定方法
酶的测定方法酶是一种生物催化剂，广泛应用于医药、食品、化工等领域。
酶的测定方法是评价酶活性的重要手段。
目前常用的酶测定方法有光度法、荧光法、比色法、电化学法等。
光度法是一种常用的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的物质吸收或发射光线的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的NADH可以吸收340nm波长的紫外线光线，因此可以通过测定吸光度来评价酶活性。
光度法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也存在一定的局限性，如受到其他物质的干扰等。
荧光法是一种新兴的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的荧光物质的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的ATP可以发射荧光，因此可以通过测定荧光强度来评价酶活性。
荧光法具有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在一定的局限性，如需要特殊的荧光探针等。
比色法是一种常用的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的物质的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的葡萄糖可以与某些试剂发生比色反应，因此可以通过测定比色强度来评价酶活性。
比色法具有操作简便、成本低等优点，但也存在一定的局限性，如受到其他物质的干扰等。
电化学法是一种新兴的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的电化学信号的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的电子可以通过电极传递，因此可以通过测定电流或电势来评价酶活性。
电化学法具有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在一定的局限性，如需要特殊的电极等。
综上所述，酶的测定方法有多种，每种方法都有其优缺点。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的测定方法。
同时，还需要注意测定条件的控制，以保证测定结果的准确性和可重复性。
酶活性的测定方法
生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。
将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。
分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。
（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）（Na+＋K+）－ATPase活性的测定1、试剂（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑 1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。
酶工程第1章酶活性单位及其测定方法
1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加
入的显色剂对－氨基苯磺酸和α －萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+ 或NADP + 在340nm处光吸收很少，而其还原
1000 0.3 15 μmol/min/mg protein 20
U/mg protein
二、酶活性测定的主要方法
温度、pH、离子强度（I=(1/2)Σ CZ 2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分
离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或
沉淀，就易于分离。
5 电化学方法
（electrochemistry）
① pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋ 或减少H＋的反应来说，用1/1000 pH单位精度的pH 计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入 酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 ② 电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物 和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微 电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变 化。 ③ 电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流 变化。
1 katal＝6×107 IU
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
酶活测定原理
酶活测定原理酶活测定是通过测定酶反应产物生成的物质量或反应速率来确定酶活性的一种方法。
这种测试被广泛应用于生物、医学、环境和食品科学领域。
本文将重点介绍酶活测定的原理和方法。
一、酶的定义和分类酶是一类具有催化生物反应能力的蛋白质，在生物体内担任调节代谢过程的重要角色。
酶的活性被认为是其特异性、选择性和效率的关键因素。
酶根据其催化反应类型，可以分为六类：1. 氧化还原酶：例如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，可以将还原剂氧化成相应的氧化物。
2. 转移酶：例如乙醛酸酯酶和谷氨酰胺转移酶，可以将一个基团从一个分子转移到另一个分子。
3. 加水酶：例如酯酶和葡萄糖苷酶，可以加入水分子切断化学键。
4. 合成酶：例如DNA聚合酶和RNA聚合酶，可以将单体结合成聚合物。
5. 裂解酶：例如蛋白酶和纤维蛋白溶解酶，可以降解大分子化合物。
6. 引导酶：例如酰基载体蛋白，可以在代谢过程中向该蛋白基团上结合或从该基团上解离。
二、酶活测定的原理酶活性通常通过测量酶反应的速率来评估。
酶反应速率与底物浓度、酶浓度、反应温度和pH值等条件有关。
在酶活测定中，这些条件必须被控制和标准化。
测量酶活性可以通过直接测量酶反应产物生成的量或测量反应底物消耗的量来进行。
下面介绍常用的酶活测定方法。
1. 进行光学密度测定酶活测定可以通过光学测量来实现。
在酯类水解反应中，酶催化酯水解为醇和羧酸。
在这种反应中，测量分离的醇透过率或吸光度变化，可以计算出相应的反应产物含量。
这种方法可以适用于其他酶反应，例如测定酒精脱氢酶催化的乙醛氧化反应。
2. 进行电化学测定另一种常用的酶活测定方法是电动势测定。
该方法用于测量电位差的变化以检测酶催化反应过程中电子的流动。
在氧化还原酶催化的反应中，测量体系中的电位差可以告诉我们酶的活性程度。
3. 进行放射性测定有些酶活性测定需要使用放射性示踪剂。
在DNA聚合酶催化下进行DNA复制实验中，可以使用放射性示踪剂来测量酶反应产物的数量。
测定酶活的原理
测定酶活的原理
测定酶活的原理是基于酶与底物的特异性结合及催化活性。
一种常用的测定方法是通过测量底物转化为产物的速度来间接衡量酶的活性。
该方法的基本步骤包括：
1. 准备一定浓度的底物溶液，使其与酶反应时达到酶的最佳工作浓度。
2. 添加一定量的酶溶液到底物中，使它们充分混合。
3. 在一定时间间隔内，取出反应液样本，并停止反应，例如通过加入酸性或碱性溶液。
4. 采用一种合适的分析方法，如光度法、荧光法或电化学法，测定样本中产生的产物的浓度。
5. 根据样本中产物浓度的变化，计算出酶的活性，通常以单位时间内产生的产物量来表示。
此外，也可以采用其他方法来直接测定酶的活性，例如测定酶的催化反应速率常数（Kcat）、酶对底物的亲和力（Km）等。
这些方法需要更复杂的实验步骤和数据处理。
总的来说，测定酶活的原理就是利用酶对底物的催化作用，通过测量底物转化为产物的速度或其他相关参数来间接或直接衡量酶的活性水平。
酶工程 酶活性单位及其测定方法
1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加 入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原 形 式 NADH 和 NADPH 在 340nm 处 光 吸 收 较 大 ， 因 此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和 NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。
1-氨基环丙烷-1-羧酸 （ACC）
第一章 酶活性单位 及其测定方法
一、酶活性单位 二、酶活性测定的主要方法
酶的活性
在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产 和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行 经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。
要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测 定方法。
酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查 酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化 某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
一、酶活性单位
酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与 酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的 大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个 酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制 剂所含的酶活性单位来表示，即u/ml。对于固体状 态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的 酶活性单位来表示，即u/mg。
4 同位素测定法
（isotope determination）
用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产 物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分 离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或 沉淀，就易于分离。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
4.2酶偶联法测定酶活性
(2)间接偶联：当无合适的Ei直接与Ex偶联时，可加
入另一种酶来将Ex与Ei连接起来。
Ex
Ea
Ei
A
B
C
D Ea: a — assistant
Ea— 辅助酶：与指示酶联系，辅助偶联反应进行的酶。
几种临床诊断酶盒的偶联反应
1.肌酸激酶 CK
肌酸磷酸＋ADP
肌酸＋ATP
HK
ATP＋葡萄糖
G-6-P+ ADP
G-6-PDH
G-6-P + NAD+
NADH +H++葡萄糖酸-6-P
内脂
HK：己糖激酶
2.ALT:
ALT
L-丙氨酸＋α-酮戊二酸
L-谷氨酸＋丙酮酸
LDH
丙酮酸＋NADH＋H+
L-乳酸＋NAD +
3.AST
AST
L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸
L-谷氨酸＋草酰乙酸
MDH
草酰乙酸＋NADH＋H +
L-苹果酸＋NAD +
使用最频繁的方法
Ex
Ei
S
Px
Pi
指示酶(Ei):常用脱氢类,如:LDH
酶偶联的连续监测法的偶 联方式：
(1)直接偶联：待测酶(Ex)+指示酶(Ei)
Ex
Ei
A
BLeabharlann C Ei: i — indicator
特点：①A、B无法直接测； ②需用Ei来催化→C，C可监测,(Ei— 指示酶) 指示酶定义：能提供直接监测的产物，起指示 偶联反应作用的酶(常为脱氢酶)
MDH：苹果酸脱氢酶
谢 谢！
第四章 酶学测定技术 酶偶联法测定酶活性 彭剑雄 中南大学湘雅医学院医学检验系
酶活性的测定
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1
酶具有高效性
酶的催化效率一般 是无机催化剂的
107 ～1013倍。
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2
酶具有专一性
酶的专一性建立在酶结构的专一性上
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3
影响酶活性测定的因素
• 一、标本 1、溶血 红细胞中某些酶的活性比血清高。 2、抗凝剂 某些抗凝剂可抑制酶的活性。因此一般都采用血清 做标本，确实需要使用血浆的，则使用肝素抗凝。 3、样品存放时间 各种血清酶的稳定性不同，故而存放时间及存放方法
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
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测定酶活性时注意事项：
6、应正确设计适当的对照管，以消除所测结果中 非酶反应生成的那一部分。测定管中的产物量必 须减去对照管中的产物量才是有酶催化生成的产 物量。
不同都会影响到酶的活性。
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第三节、影响酶活性测定的因素
• 二、测定条件 酶活性易受到条件如温度、PH、底物浓度等影响。因
此，在酶活性测定时，要控制在最佳条件下进行。 这样，不仅酶的活性最高，相对误差最小，而且酶 活性受测定条件变化的影响也小。在此主要介绍底 物浓度对酶活性影响及反映相互关系的米氏方程。
（1）样品对照：只加样品不加底物 （2）底物对照：不加样品只加底物 （3）时间对照：含有酶和底物但反应时间为零的对
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
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酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
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一、过氧化物酶（POD）活性的测定
POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V T
POD活性=
0.01×t×Vs×W
式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；
V T ----提取酶液的总体积（ml）
t----反应的时间（min）
Vs ----测定时取用酶液体积（ml）
W----样品鲜重（g）
二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定
多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T
0.01×t×0.5g×V s
= O D×V T
0.005
OD——反应时间内吸光值的变化；
V T ----提取酶液的总体积（ml）
Vs ----测定时取用酶液体积（ml）
T———反应时间(min)；
三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定
参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
标准曲线的制定，配制浓度0~ 250 μg/ml的IAA溶液，分别在530nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。
IAAO活性测定：量取1ml 酶液+2ml 1mmol/L MnCl2 +1ml 1mmol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+5mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液，放入30℃的水浴中30min,对照为2ml 1mol/L的MnCl2+1ml 1mol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+6ml PH=6.0 磷酸缓冲液。
将上述溶液吸取2ml，与4ml反应液（0.5mol/L的FeCl31.0ml+35%的过氯酸30ml）混合置于黑暗处，30℃条件下保存30min，最后测定530nm下的吸光度，并计算酶活性。
IAAO活性以每mg蛋白质在1h内分解破坏1μg IAA的酶量表示酶活性大小。
（C 1- C2）×V T
吲哚乙酸氧化酶活性=
W×t×V1[μg/ （g·h ）]
式中：C1——对照管在标准曲线上查得IAA, μg ；
C2 ——测定管在标准曲线上查得IAA, μg ；
V T——酶液稀释后总体积，mL ；V1——酶液反应时用体积，mL
W ——样品重量，g ；t ——酶促时间，h
四、超氧物歧化酶（SOD）活性的测定
多酚氧化酶活性测定参照赵世杰等的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5ml 0.05mol/L磷酸缓冲液（PH=7.8），冰浴研磨成浆，4℃条件下10000r/min离心10min后上清液即为酶液。
SOD活性测定：反应试管中分别加入1.5 mL磷酸缓冲液，0.3 mL130m mol ／L的Met溶液，0.3 mL750μmol/LNBT溶液，0.3 mL100μmol/LEDTA-Na2溶液，0.3 mL20μmol/L核黄素，0.25mL蒸馏水，0.05 mL的酶液（对照加缓冲液，2支）。
混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低可适当延长）。
反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光光化还原的50﹪为一个酶活性单位表示。
SOD总活性=[(A ck-A E)×V]／[A ck×1／2×W×a]
SOD比活力=SOD总活性／蛋白质浓度
SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示；
A ck--照光对照管的消光度值；A E—样品管的消光度值；
V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml）
W—样重(g)
蛋白质浓度单位为：mg蛋白／g样重
五、过氧化氢（CAT）活性的测定
0.15 mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液
反应液配制：取200mlPBS（0.15mol，PH=7.0），加入0.3092ml 30‰的H2O2（原液摇匀即可）
酶液制备：称取样品0.2g，加入5ml 0.15mol/L磷酸缓冲液（PH=7.0），冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。
样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（μ）
CAT=[△A240×Vt]／（0.01×t×W×V s）（μ／g.min）
△A240—反应时间内吸光度的变化
W—样品鲜重（g）
t—反应时间（min）
Vt—提取酶液总体积（ml，1.6ml）
V s—测定时取用酶液体积（ml，0.1ml）。