血液学检验-第六章-造血干细胞移植相关检验技术
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第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
3. 高效液相色谱（high performance liquidchromatography，HPLC）
是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交 换过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附能力、 离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质 进行分离。HPLC对PCR产物的定量检测具有高敏感性、高准 确性、高重复性以及快速、无污染的优势，与STR技术的结 合势必为移植后植入证据的检测开辟一个新的领域。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
3. 血清免疫球蛋白谱 由于免疫球蛋白多肽链上氨基酸的 不同，各类及各型Ig表现出不同的抗原特异性。Ig的抗原决 定簇是由遗传决定的，表现出同种异型，具有遗传多态性。 Ig重链同种异型表现在IgG、IgA和IgE 3类免疫球蛋白上， 轻链的同种异型表现在J链上。为了排除由于输血带来的外 源性Ig的影响，对免疫球蛋白的同种异型分析通常在最近一 次输血100天后进行。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
4.性染色体核型分析 人类体细胞第23对染色体（性染色 体）在女性为XX，男性为XY，利用这一差别可区分当供、 受者性别不同时HSC植入状态。用常规染色体核型分析检测 受者的骨髓或外周血的有核细胞时，若发现女性受者的性 染色体核型变为XY或男性受者的性染色体核型变为XX，则 表明供者的HSC已植入。但该方法的敏感性较低，大约为1% ～10%。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
第一节 造血干细胞的采集与计数
第 第一 六章 章 造 造血血及干造细血胞调移控植 相关检验技术
第一节 造血器官与造血微环境 第二节 造血干细胞植入效果的检验
新乡医学院 牛新清
目录
一、植入状态的检验 二、嵌合体检验
一、植入状态的检验
1. 红细胞血型 用该方法判断植入是否成功的原理是在红 细胞血型系统中，供者与受者的血型不同。移植后若受者 表现为供者的血型，与供者的交叉配血实验无反应，则表 明allo-HSC已植入。常用的血型系统为ABO血型系统，但也 可以利用其他血型系统来识别供、受者间的差异。该方法 是一种定性方法，移植后入状况检测。
临床血液学检验技术
第 第一 六章 章 造 造血血及干造细血胞调移控植 相关检验技术
第第一一节节造造血血干器细官胞与的造采血集微与环计境数
新乡医学院 牛新清
目录
一、外周血造血干细胞动员与采集 二、造血干细胞计数
第一节 造血干细胞的采集与计数
概述
造血干细胞移植（hemapoietic stem cell transplantation, HSCT）就是将供者的造血干细胞取 出体外作为移植物（graft），然后回输移植给经过预处 理的受者，重建受者造血和免疫系统的过程。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
5.HLA抗原 HLA遗传区域是人体的主要组织相容性复合 体（major histocompatibility complex，MHC），它位 于人类第6号染色体短臂上，包含着已发现的HLA-A、B、 C、D、DR、DQ和DP等7个座位，可产生上亿种表型。移植 后如果受者在移植前与供者不相同的某一HLA位点转换为 与供者相同，则表明成功植入。
按供受者之间人类白细胞抗原（HLA）相配程度又可分为： HLA相配移植（HLA-matched transplantation） HLA半相合移(haploidentical Transplantation) HLA不配移植（HLA-mismatched transplantation）
第一节 造血干细胞的采集与计数
(3)它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附能力、离子 交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进 行分离。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
2. VNTR、STR和VNTR/STR-PCR (1)在检测嵌合体的各种方法中可变数目串联重复（variable number tandem repeats，VNTR）尤其适用于早期检测，其变 化所致的DNA多态性可用人工合成的寡核苷酸探针检测。当结 合Southern印迹分析时，即使目标DNA仅占DNA总量的1%～2% 时，寡核苷酸探针仍可检测出混合嵌合体。
第一节 造血干细胞的采集与计数
二、造血干细胞计数
如果需要计数CD34+细胞的绝对数量，只需要在标本中加入已知 数量的荧光微球，按照公式计算CD34+细胞的绝对数 （获取CD34+细胞数/获取微球数）×（每管内微球数/标本体积）。
第一节 造血干细胞的采集与计数
第一节 造血干细胞的采集与计数
临床血液学检验技术
(1)RFLP是一种非常有效的区别供者和受者DNA多态性的方法。 RFLP可通过失去或获得限制酶作用位点，或通过在限制部位插 入或造成DNA的缺失而产生，前者通常为2个等位基因的多态性，
而后者则为多个等位基因多态性。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
(2)用特异探针区别供者和受者独特的等位基因，经 Southern杂交显示出DNA“指纹图谱”，利用供、受者之 间指纹图谱的差异判断是否植入。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
在造血干细胞移植中，造血嵌合体是指供体来源的造 血细胞部分或完全植入到受体体内形成的两种不同来源的 细胞混合物。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
1.限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP)
第一节 造血干细胞的采集与计数
二、造血干细胞计数
目前，常用国际血液治疗与移植工程学会 （International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE）方案计数CD34+细胞百分率。 ISHAGE方案主要内容包括： (1)使用4个参数：CD34-PE(HPCA-2-PE)、CD45-FITC、SSC\FSC； (2)采用一套累积设门法分析CD34+细胞； (3)获取至少75000个CD45+细胞及100个CD34+细胞； (4)以CD45+白细胞为分母计数CD34+细胞百分率。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
2．红细胞同工酶谱 红细胞同工酶有遗传多态性，可以用于区分 供者和受者的造血干细胞移植状态。应用前提为供、受者红细胞 同工酶的表型不同。该技术的基本原理是将电泳技术与酶显色方 法结合起来，根据酶蛋白分子的大小和所带电荷的不同，通过电 泳使之分离。然后利用酶的特异催化活性，作用于底物而显色。 根据各种同工酶特有的谱型（谱带的位置、数目、泳动速度、活 性强弱等）可判别同工酶的型别。该方法敏感性较红细胞血型法 高，但仍只能分析红细胞系统的植入状态，常需分析多个同工酶 谱以找到供受者间差异。该方法易受输血情况影响。
一、外周血造血干细胞动员与采集
1．造血干细胞动员 造血干细胞动员是指将造血干/祖细胞从骨髓中动员到外 周血的过程。动员方法包括应用造血生长因子、骨髓抑制性 化疗，以及骨髓抑制性化疗加造血生长因子。
第一节 造血干细胞的采集与计数
一、外周血造血干细胞动员与采集
2．外周血干细胞的采集和保存 (1) PBSC采集：采用全自动血细胞分离机连续分离外周血中单 个核细胞。成人PBSC单采时血液流速一般为50～70ml/min，循 环总量为10～15L（2～3倍自身血液容量）。 (2)PBSC处理：每次采集PBSC的总体积为150～400ml，循环血 量15L时采集的有核细胞数约为（10～80）×109个，其中90% 以上为单个核细胞，CD34+细胞占0.1%～5.0%，还有少量分叶 核细胞、红细胞，红细胞含量一般不超过15ml；肿瘤患者的自 体PBSC中，还可能混有少量肿瘤细胞。
根据造血干细胞来源的组织和器官不同，HSCT可分为： 脐血移植 （CBT） 骨髓移植（BMT） 外周造血干细胞移植（PBSC）。
第一节 造血干细胞的采集与计数
概述
根据造血干细胞的供体，HSCT 可分为： 自体（Auto-）移植 同种同基因（Syn-）移植 同种异基因(Allo）移植： 血缘供者（sibling donor）移植 非血缘供者（unrelated donor）移植
第二节 造血干细胞植入效果的检验
本章小结
造血干细胞移植植入证据的检测已经成为移植后常规检查 项目。植入证据的检测方法多种多样，不同检测方法各有其特 点。红细胞血型，性染色体核型分析因其简便可靠将仍具有独 特的应用价值；VNTR和STR因其呈高度多态性，可提供信息量大 ，已成为目前广泛应用的移植后植入证据的检测方法；DNA定量 分析鉴定嵌合体对于一些具有探索性的新移植技术，如去除T细 胞的移植、非清髓性干细胞移植等具有特别重要的作用。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
(2)短片段串联重复（short tandem repeats，STR），也 称微卫星标记，具有高度多态性及个体特异性。STR基因分 型技术已广泛应用于人类学、遗传学、亲子鉴定和法医个 体识别等研究领域，可准确判定性别、血型、HLA全相合时 的异基因造血干细胞移植是否存活。
二、嵌合体检验
3. 高效液相色谱（high performance liquidchromatography，HPLC）
是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交 换过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附能力、 离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质 进行分离。HPLC对PCR产物的定量检测具有高敏感性、高准 确性、高重复性以及快速、无污染的优势，与STR技术的结 合势必为移植后植入证据的检测开辟一个新的领域。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
3. 血清免疫球蛋白谱 由于免疫球蛋白多肽链上氨基酸的 不同，各类及各型Ig表现出不同的抗原特异性。Ig的抗原决 定簇是由遗传决定的，表现出同种异型，具有遗传多态性。 Ig重链同种异型表现在IgG、IgA和IgE 3类免疫球蛋白上， 轻链的同种异型表现在J链上。为了排除由于输血带来的外 源性Ig的影响，对免疫球蛋白的同种异型分析通常在最近一 次输血100天后进行。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
4.性染色体核型分析 人类体细胞第23对染色体（性染色 体）在女性为XX，男性为XY，利用这一差别可区分当供、 受者性别不同时HSC植入状态。用常规染色体核型分析检测 受者的骨髓或外周血的有核细胞时，若发现女性受者的性 染色体核型变为XY或男性受者的性染色体核型变为XX，则 表明供者的HSC已植入。但该方法的敏感性较低，大约为1% ～10%。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
第一节 造血干细胞的采集与计数
第 第一 六章 章 造 造血血及干造细血胞调移控植 相关检验技术
第一节 造血器官与造血微环境 第二节 造血干细胞植入效果的检验
新乡医学院 牛新清
目录
一、植入状态的检验 二、嵌合体检验
一、植入状态的检验
1. 红细胞血型 用该方法判断植入是否成功的原理是在红 细胞血型系统中，供者与受者的血型不同。移植后若受者 表现为供者的血型，与供者的交叉配血实验无反应，则表 明allo-HSC已植入。常用的血型系统为ABO血型系统，但也 可以利用其他血型系统来识别供、受者间的差异。该方法 是一种定性方法，移植后入状况检测。
临床血液学检验技术
第 第一 六章 章 造 造血血及干造细血胞调移控植 相关检验技术
第第一一节节造造血血干器细官胞与的造采血集微与环计境数
新乡医学院 牛新清
目录
一、外周血造血干细胞动员与采集 二、造血干细胞计数
第一节 造血干细胞的采集与计数
概述
造血干细胞移植（hemapoietic stem cell transplantation, HSCT）就是将供者的造血干细胞取 出体外作为移植物（graft），然后回输移植给经过预处 理的受者，重建受者造血和免疫系统的过程。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
5.HLA抗原 HLA遗传区域是人体的主要组织相容性复合 体（major histocompatibility complex，MHC），它位 于人类第6号染色体短臂上，包含着已发现的HLA-A、B、 C、D、DR、DQ和DP等7个座位，可产生上亿种表型。移植 后如果受者在移植前与供者不相同的某一HLA位点转换为 与供者相同，则表明成功植入。
按供受者之间人类白细胞抗原（HLA）相配程度又可分为： HLA相配移植（HLA-matched transplantation） HLA半相合移(haploidentical Transplantation) HLA不配移植（HLA-mismatched transplantation）
第一节 造血干细胞的采集与计数
(3)它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附能力、离子 交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进 行分离。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
2. VNTR、STR和VNTR/STR-PCR (1)在检测嵌合体的各种方法中可变数目串联重复（variable number tandem repeats，VNTR）尤其适用于早期检测，其变 化所致的DNA多态性可用人工合成的寡核苷酸探针检测。当结 合Southern印迹分析时，即使目标DNA仅占DNA总量的1%～2% 时，寡核苷酸探针仍可检测出混合嵌合体。
第一节 造血干细胞的采集与计数
二、造血干细胞计数
如果需要计数CD34+细胞的绝对数量，只需要在标本中加入已知 数量的荧光微球，按照公式计算CD34+细胞的绝对数 （获取CD34+细胞数/获取微球数）×（每管内微球数/标本体积）。
第一节 造血干细胞的采集与计数
第一节 造血干细胞的采集与计数
临床血液学检验技术
(1)RFLP是一种非常有效的区别供者和受者DNA多态性的方法。 RFLP可通过失去或获得限制酶作用位点，或通过在限制部位插 入或造成DNA的缺失而产生，前者通常为2个等位基因的多态性，
而后者则为多个等位基因多态性。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
(2)用特异探针区别供者和受者独特的等位基因，经 Southern杂交显示出DNA“指纹图谱”，利用供、受者之 间指纹图谱的差异判断是否植入。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
在造血干细胞移植中，造血嵌合体是指供体来源的造 血细胞部分或完全植入到受体体内形成的两种不同来源的 细胞混合物。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
1.限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP)
第一节 造血干细胞的采集与计数
二、造血干细胞计数
目前，常用国际血液治疗与移植工程学会 （International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE）方案计数CD34+细胞百分率。 ISHAGE方案主要内容包括： (1)使用4个参数：CD34-PE(HPCA-2-PE)、CD45-FITC、SSC\FSC； (2)采用一套累积设门法分析CD34+细胞； (3)获取至少75000个CD45+细胞及100个CD34+细胞； (4)以CD45+白细胞为分母计数CD34+细胞百分率。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
一、植入状态的检验
2．红细胞同工酶谱 红细胞同工酶有遗传多态性，可以用于区分 供者和受者的造血干细胞移植状态。应用前提为供、受者红细胞 同工酶的表型不同。该技术的基本原理是将电泳技术与酶显色方 法结合起来，根据酶蛋白分子的大小和所带电荷的不同，通过电 泳使之分离。然后利用酶的特异催化活性，作用于底物而显色。 根据各种同工酶特有的谱型（谱带的位置、数目、泳动速度、活 性强弱等）可判别同工酶的型别。该方法敏感性较红细胞血型法 高，但仍只能分析红细胞系统的植入状态，常需分析多个同工酶 谱以找到供受者间差异。该方法易受输血情况影响。
一、外周血造血干细胞动员与采集
1．造血干细胞动员 造血干细胞动员是指将造血干/祖细胞从骨髓中动员到外 周血的过程。动员方法包括应用造血生长因子、骨髓抑制性 化疗，以及骨髓抑制性化疗加造血生长因子。
第一节 造血干细胞的采集与计数
一、外周血造血干细胞动员与采集
2．外周血干细胞的采集和保存 (1) PBSC采集：采用全自动血细胞分离机连续分离外周血中单 个核细胞。成人PBSC单采时血液流速一般为50～70ml/min，循 环总量为10～15L（2～3倍自身血液容量）。 (2)PBSC处理：每次采集PBSC的总体积为150～400ml，循环血 量15L时采集的有核细胞数约为（10～80）×109个，其中90% 以上为单个核细胞，CD34+细胞占0.1%～5.0%，还有少量分叶 核细胞、红细胞，红细胞含量一般不超过15ml；肿瘤患者的自 体PBSC中，还可能混有少量肿瘤细胞。
根据造血干细胞来源的组织和器官不同，HSCT可分为： 脐血移植 （CBT） 骨髓移植（BMT） 外周造血干细胞移植（PBSC）。
第一节 造血干细胞的采集与计数
概述
根据造血干细胞的供体，HSCT 可分为： 自体（Auto-）移植 同种同基因（Syn-）移植 同种异基因(Allo）移植： 血缘供者（sibling donor）移植 非血缘供者（unrelated donor）移植
第二节 造血干细胞植入效果的检验
本章小结
造血干细胞移植植入证据的检测已经成为移植后常规检查 项目。植入证据的检测方法多种多样，不同检测方法各有其特 点。红细胞血型，性染色体核型分析因其简便可靠将仍具有独 特的应用价值；VNTR和STR因其呈高度多态性，可提供信息量大 ，已成为目前广泛应用的移植后植入证据的检测方法；DNA定量 分析鉴定嵌合体对于一些具有探索性的新移植技术，如去除T细 胞的移植、非清髓性干细胞移植等具有特别重要的作用。
第二节 造血干细胞植入效果的检验
二、嵌合体检验
(2)短片段串联重复（short tandem repeats，STR），也 称微卫星标记，具有高度多态性及个体特异性。STR基因分 型技术已广泛应用于人类学、遗传学、亲子鉴定和法医个 体识别等研究领域，可准确判定性别、血型、HLA全相合时 的异基因造血干细胞移植是否存活。