第六章 化学物质与蛋白质的相互作用3-4节

2、氨基的化学修饰
• 有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸 (TNBS)就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸残基反应， 在420 nm和367nm能够产生特定的光吸收。 • 在蛋白质序列分析中，用于多肽链N-末端残基的测定的化合 修饰方法--2，4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和 苯异硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修饰方法。
1、可与蛋白质发生反应的化合物
• 除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内 代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细 胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结 合。 • 例如蛋白质分子中的亲核基团、DNA、RNA及一 些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。
表6-1 可与蛋白质形成共价加合物的化合物类型
二、特定的氨基酸残基侧链基团的修饰
• 蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试 剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实 现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。 • 理想情况下，修饰试剂只是有选择地与某一特定的残基反 应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。 • 在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所 造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子 中的功能。
3、羧基的化学修饰
• 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团，目 前已成为一种应用最普遍的标准方法，它在比较温和的条件 下就可以进行。
4、咪唑基的化学修饰
• 焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。该 试剂在接近中性的情况下表现出比较好的专一性，与组氨酸 残基反应使咪唑基上的1个氮羧乙基化，并且使得在240 nm 处的光吸收增加。 • 该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残 基。
一、蛋白质吸光探针
• 金属探针 • 染料探针
双缩脲法
双缩脲在碱性溶液中与 Cu2+生成紫红 化合物的反应。肽和蛋白质化合物都有 双缩脲反应，生成紫红色化合物，在 540nm具有光吸收。
将双缩脲试剂和Folin酚试剂(磷钼酸盐磷 钨酸盐）结合使用，在蛋白质发生双缩 脲反应之后，再和Folin酚试剂反应，此 试剂在碱性条件下被蛋白质中酪氨酸的 酚基还原，生成颜色更深的化合物，在 640nm具有光吸收，可测定25-250ug蛋 白质 在碱性条件下，肽键与铜离子反应生成 Cu(I), Cu(I)再与BCA反应形成紫色络合物， 在565nm测量吸光度。二喹啉甲酸（又称 双辛可宁酸法的试剂比Folin-Lowry法的试 剂稳定,干扰少
1、巯基的化学修饰
• 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，如碘乙酸和碘乙酰 胺，用于多肽链氨基酸顺序分析过程防止半胱氨酸的氧化。 • 5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又称为Ellman试剂，目前 已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可与巯基反应形成二 硫键，产生的5-巯基-2-硝基苯甲酸阴离子在412nm具有很强 的吸收，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。 • 有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的 是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯 基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应。
瑞利散射起源
• 1871年，瑞利在经过反复研究，反复计算的基础上，提 出了著名的瑞利散射公式，当光线入射到不均匀的介质中， 如乳状液、胶体溶液等，介质就因折射率不均匀而产生散 射光。瑞利研究表明，即使均匀介质，由于介质中分子质 点不停的热运动，破坏了分子间固定的位置关系，从而也 产生一种分子散射，这就是瑞利散射。 • 瑞利经过计算认为，分子散射光的强度与入射光的频率 （或波长）有关，即四次幂的瑞利定律。
• 定义1：尺度远小于入射光波长的粒子所产生的散射现象。 根据英国物理学家瑞利(Lord John William Rayleigh， 1842—1919)研究指出，分子散射强度与入射光的波长四次 方成反比, 且各方向的散射光强度是不一样的。
• 定义2：在介质中传播的光波，由于材料的原子或分子结构 随距离变化而引起的散射。
第四节
蛋白质光谱探针
Spectroscopic probe of proteins
蛋白质光谱探针
• 蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经常涉及的 分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗效果的重要指标， 还是药物和食品分析的常见项目。 • 所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机 离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超 分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供 蛋白质浓度或结构方面的信息。 • 蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最广的还是 吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等分子光谱探针。
考马斯 亮蓝
二、蛋白质荧光探针
• 蛋白质中存在着Tyr、Trp、Phe残基，能够吸收270～ 300nm的紫外光而发出紫外荧光。 • 当测定体系中加入小分子配体时，小分子配体与蛋白质发 生相互作用,会导致蛋白质荧光的猝灭，利用小分子配体 对蛋白质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与小分 子配体的作用类型及结合部位等。
5、酚和脂肪族羟基的化学修饰
• 四硝基甲烷（TNM）由于反应的高度专一性和反应条件比较 温和，已经成为酪氨酸残基修饰最常用的试剂，它与酪氨酸 残基反应生成离子化的发色基团---3-硝基酪氨酸衍生物。 • 苏氨酸和丝氨酸残基的专一性化学修饰研究较少 ，其羟基可 被修饰酚羟基的修饰试剂所修饰，只是反应更严格。
• 蛋白质分子中有许多功能基团可与外源化合物相互作用，除各种氨基酸分 子普遍存在氨基和羧基外，丝氨酸和苏氨酸所特有的羟基、半胱氨酸分子 中得巯基…..
• 一旦这些部位与外源化合物发生共价结合，必将影响蛋白质结构和功能。 • 致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷 和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作 用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。
6、胍基的化学修饰
• 丁二酮和1,2-环己酮与胍基反应可逆地形成精氨酸-丁二酮复 合物，该产物可以与硼酸结合而稳定下来。 • 苯乙二醛是最早用来对精氨酸残基进行修饰的，通常是两个 分子的苯乙二醛与1个精氨酸残基不可逆地结合，该试剂与 α-氨基也有一定反应性。 • 4-羟基-3-硝基苯乙二醛在温和条件下修饰精氨酸残基，具有 光吸收性质，可使被修饰的精氨酸残基在405nm处具有光吸 收效应。 • 对硝基苯乙二醛修饰精氨酸残基可以得到唯一的产物
瑞利散射的实验支持
• 如右图所示，将强光源S所发出的光束入射到装满水的玻 璃容器上，水内加上几滴牛奶使之成为浑浊物质，光通过 这类物质后发生散射，从正侧方向（垂直于入射光的传播 方向，如Z方向）观察时，散射光带青蓝色，即此入射光 含有较多的短波；从面对入射光的方向（X方向）看，则 通过容器的光显得比较红。
一、生物体内蛋白质加合物的形成
• 许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同细胞 大分子的亲核部位(如蛋白质的巯基)发生不可逆结合具有 密切关系。 • 当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子， 如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化， 即导致DNA损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤 或死亡。 • 外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共 价结合和共价结合。
H NH SO 3
-
H 3C
N
SO3
-
1-苯胺基-8-萘磺酸 (ANS) 2-对甲苯胺基萘-6-磺酸 (TNS)
,,,- 4(对磺苯基)卟啉 ( TPPS4) ,,,- 4 (对羧苯基)卟啉(TCPP)
三、蛋白质光散射探针
• 共振光散射（RLS）技术是近年来发展起来研究小分子物 质与蛋白质、核酸等生物大分子发生作用并形成聚集体的 灵敏的探测技术。 • 瑞利散射（Rayleigh scattering ）：
三、亲和性标记
• 亲和标记试剂，这些化合物是具有化合反应性的蛋白质分 子的底物或配体的类似物。由于结构的相似性，它们对底 物或配体的结合部位具有一定的亲和性，因而能够选择性 地结合在蛋白质分子共价结合。 • 这类试剂具有饱和性，与底物或天然配体竞争蛋白质分子 的结合位点。 • 亲和性标记试剂中最重要的是光亲和标记和自杀性抑制剂 （见第七章）
试剂类型 烷基化 芳香基化 化合物或前体 卤代物 环氧化物 硫酸烷基酯 活泼的烯烃
羰基化合物 酰基化 磷酰化 自由基 具有亲电氮化合物 醛 有机酸酐、酰氯等 有机磷 · OH、· 3 CCl 芳香胺
反应机制 亲核取代
1,4-加成
形成席佛碱 亲核取代或加成 亲核取代 自由基反应 亲核取代
2、蛋白质分子中的可反应基团
散射的观察与应用
• 正午时，太阳直射地球表面，太阳光在穿过大气层时，各 种波长的光都要受到空气的散射，其中波长较长的波散射 较小，大部分传播到地面上。而波长较短的蓝、绿光，受 到空气散射较强，天空中的蓝色正是这些散射光的颜色， 因此天空会呈现蓝色。 • 正是由于波长较短的光易被散射掉，而波长较长的红光不 易被散射，它的穿透能力也比波长短的蓝、绿光强，因此 用红光作指示灯，可以让司机在大雾迷漫的天气里容易看 清指示灯，防止交通事故的发生。
• 溴苯是一种重要的肝脏毒物，进入体内后经细胞色素 P450作用形成溴苯-3,4-环氧化物，可与蛋白质、DNA等 共价结合。
4、与血红蛋白的共价结合
• 外源化合物进入血液后，可与红细胞膜结合而进入红细胞 内与血红蛋白发生共价结合。其中血红蛋白氨基酸中的氨 基、巯基易与外源化合物发生共价结合。 • 烷基化试剂可与血红蛋白末端氨基酸的氨基、半胱氨酸的 巯基以及组氨酸咪唑环上N1或N3共价结合。 • 环氧乙烷、环氧丙烷可与血红蛋白中组氨酸、末端氨基酸 残基共价结合； • 4-氨基联苯、苯胺经体内代谢氧化后可与半胱氨酸的巯基 结合。
3、与白蛋白的共价结合
• 白蛋白是血液和组织间质中的主要蛋白质，也是脂肪酸、 内源性（生物体内存在的）化合物及外源性运输的主要载 体，它容易与终致癌物结合形成共价加合物。
5、与细胞内蛋白质共价结合
• 进入体内的外源化合物或其代谢产物可与胞浆、质膜以及 细胞核内蛋白质发生共价结合而形成加合物，已经发现有 数十种外源化合物与蛋白质共价结合与其毒性有密切关系。
金 属 探 针
FolinLowry法
双辛可 宁酸法
染 料 探 针
染料探针是 蛋白质分析 中种类最多 应用最广的 一类探针， 该法是利用 蛋白质与染 料结合成沉 淀或改变结 合染料的光 吸收特性， 借助染料颜 色的减退或 变化的程度 来测定蛋白 质的含量。
溴酚蓝
一种研究性能优良的探 针试剂，该试剂颜色对比 度为160nm,反应在pH3.2 左右进行，在600nm测量 吸光度。 在酸性条件下，染料考马斯 亮兰G-250 与蛋白质结合后 其吸收峰从465移至595nm 处，而颜色也由棕黄色转为 深兰色。蛋白质与染料生成 复合物颜色的深浅与其浓度 成比例关系。该方法使用方 便，反应时间短，染色稳定 成为灵敏度最高的染料探针 分析方法。
第三节
化学物质对蛋白质侧Fra Baidu bibliotek基团的共价
修饰作用
Covalent modification of protein side-chain groups by chemicals
化学物质的共价修饰作用
• 化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物 质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断 化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外 主要用化合修饰的方法。 • 该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基 础手段。
荧光探针的条件
• 探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合， 并且结合比较牢固； • 探针的荧光必须对环境条件敏感； • 蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。
• 在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定及与金属 离子结合的计量化学等。
• 常用的蛋白质荧光探针有：1-苯胺基-8-萘磺酸 (ANS)、 2-对甲苯胺基萘-6-磺酸 (TNS)、1-(N-二甲胺)萘-5-磺酸 (DNS)和荧光胺等。