马铃薯腐烂茎线虫28SrDNA_D2_D3区序列分析

植物病理学报A CTA PHY TO PA THO LOG ICA SI N ICA 39(3):254 261(2009)收稿日期:2008 03 21;修回日期:2009 04 15基金项目: 973 项目(2009CB119200);国家自然科学基金资助项目(30871627);国家 十一五 科技支撑计划(2006BAD08A14)通讯作者:彭德良,研究员,主要从事植物线虫分子生物学研究;E m ai:l dlpeng @caas .n et .cn第一作者:于海英(1981-),女,吉林白城人,云南农业大学2005级硕士研究生,主要从事植物线虫学研究;E m ai:l yuhai y i ng1981@163.co m 。

马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析于海英1,2,彭德良1,胡先奇2,黄文坤1(1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;2云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明650201)摘要:我国危害甘薯的马铃薯腐烂茎线虫rDNA IT S 基因片段长度存在A 型(900bp)和B 型(1100bp)2个类型,A 型腐烂茎线虫群体的IT S 片段比B 型群体少200bp 。

为了进一步研究这2种类型群体的发育关系,本文用线虫通用引物D 2A 和D 3B 对来自国内的21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国的马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D 2/D 3区进行了PCR 扩增,均产生大小一致的片段,长度约为780bp ,克隆、测序后用DN AM AN 5.2软件和M EG A 4软件进行分析比对,结果表明我国21个马铃薯腐烂茎线虫群体28S rDNA D 2/D 3区只有20余个碱基的差异,相似率达97.2%。

基于U PGM A 构建的系统发育树很好地区分了马铃薯腐烂茎线虫A 型和B 型群体,展现出了群体的来源及发育关系。

关键词:马铃薯腐烂茎线虫;D 2/D 3区片段;序列分析M o lecu la r c lo n ing a nd sequ en ce s an a l y s is o f 28S rDNA D2/D3reg i o ns o f D ity len chus d es tru cto r o n sw ee t po ta to in Ch ina YU H a i y i n g 1,2,PENG D e liang 1,HU X i a n qi 2,HUANG W en kun 1(1The S t a te K ey L abora t o ry fo r B i o l o gy o f D isease and Insect Pe sts ,In stitute o f P lan t P ro tec tion ,Ch inese A cade m y o f A gr i cult ural Sc i ences ,Be iji ng 100193,Ch i na ;2K ey L abo ra t o ry o f A g ricultura l B iodive rsit y and Pe sts Con tro ,lM i n istry of Educa tion ,Y unnan A g r i cultural U n i v ersit y,K un m ing 650201,Ch i na)Ab stra ct :Tw o types of r D NA I TS (Type A,900bp and Type B,1100bp)w ere de m onstrated to ex ist in D ity lenchu s destructor populations on s w eet po tato i n Ch i n a .The D 2/D 3reg i o ns o f 28S r D NA fro m 22popu lation s ofD.destructo r w ere a m p lifi e d w it h un iversal pri m er pairsD 2A and D 3B .A ll 22populations y ie l d ed one sing l e frag m ent about 780bp .Sequence ana l y sis and align m ent w ere conduc ted by usi n g the so ft w are M EGA 4and DNAM AN5.2and a ll22sequencesw ere sub m itted at t h e G enB ank .The results show ed t h at se quence d ifference s of D 2/D3reg i o n w ere only in a fe w sites ,and t h at t h e si m ilarity w a s 97.2%.Tw o types cou l d be disti n g uished i n t h e phy l o g enetic tree by usi n g UPGM A m ethod .The evo l u tionary re lationship be t w een t w o types and t h e o rig i n o fD ity lenc hu s spec i e sw ere d iscussed .Key w o rd s:D ityle nchus destructo r;D 2/D3expan si o n segm en ts ;sequences analy sis中图分类号:S435.31 文献标识码:A 文章编号:0412 0914(2009)03 0254 08马铃薯腐烂茎线虫(D ity lenchu s destructo r )是我国重要的进境植物检疫性有害生物[1],在我国主要分布于河北、山东、北京等地,主要危害甘薯,是甘薯生产上重要的病害之一。

线虫形态特征的重叠交错和形态的多样性使得传统的形态学鉴定变得困难,随着分子生物学技术的飞速发展,分子诊断成为植物线虫研究的新途径[2]。

物种的多样性最本质的体现在核酸的结构差异上,对核酸的分析可使我们了解物种进化历史的精确信息。

在真核生物中核糖体RNA 包括大小3期于海英,等:马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析亚基,核糖体小亚基的序列被广泛应用于分子系统发育的研究,尤其是关于生物体也包括线虫的深层进化关系的研究[3]。

目前,通过对整个线形动物门中不同分类群体的核糖体小亚基序列的研究,为线虫的分子系统发育关系的研究提供了较全面且可靠的方法[4],但是有关大亚基在线虫分类中的研究相对很少。

线虫中核糖体大亚基一般指的是28S RNA基因,28S r D NA是核糖体大亚基r RNA的转录基因,序列中既有保守区又有可变区。

在进化过程中, 28S r D NA中的D区序列片段一直被认为是丰余的结构,因为这些片段不会妨碍核糖体的功能,但是D区序列片段也可以用来解释基因片段中的部分变异,特别是D3区常常用于研究不同地理来源的不同线虫种样品间的序列多样性[5]。

近年来, 28S r D NA D2/D3区大量的应用于许多物种的研究,在属、种的分类及亲缘种的鉴定等方面发挥了重要作用[6,7],并且在线虫中也开展了广泛的研究。

28S的D3序列可以很好地将4种常见根结线虫(M el o i d ogyne hap l a、M.a rena ria、M.inco gnita、M.j a vanica)区分开[8];28S r D NA D2/D3序列用于研究垫刃目的根腐线虫(Pra tylenchus),潜根线虫(H irschm anniella)、根结线虫(M e l o i d o gyne)、穿孔线虫(Rado pho lus)、螺旋线虫(H elico tylenchus)和盘旋线虫(Ro tylenchus)的系统发育关系[9~12]; L i等[13]对香蕉穿孔线虫r R NA基因的D2/D3区序列进行了分析比对,Jiang等[14]也成功地利用28S r D NA D2/D3区特征将伞滑刃线虫属部分种群进行区分,可见28S r DNA D2/D3区带有的系统发育信息,可为线虫系统发育比较和鉴定提供重要的依据。

本实验室已经对来源于国内21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国马铃薯腐烂茎线虫群体的r DNA I TS进行了研究,扩增出942bp和1130bp 2个大小不同的片段,经克隆、测序和序列比对后发现I TS区存在很大差异,根据片段的大小将马铃薯腐烂茎线虫分为A型群体和B型群体,A型群体的I TS扩增片段明显比B型群体少了约200 bp,说明马铃薯腐烂茎线虫的不同群体间很可能出现了分化现象[15,16],设计构建并筛选出A型、B 型马铃薯腐烂茎线虫2对特异性引物D dS1/D dS2和D dL1/D dL2,分别扩增出A型马铃薯腐烂茎线虫、B型马铃薯腐烂茎线虫群体的特异片段252bp 和485bp;引入D3A/D3B作为内标,设计出一步双重PCR检测技术[16];本研究的目的是研究马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体在核糖体DNA28S 上的差异,分析系统发育的关系。

因此,对22个马铃薯腐烂茎线虫群体28S r DNA的D2/D3区域进行了序列扩增和分析,并且建立了系统发育树进行亲缘关系分析。

1 材料与方法1.1 材料供试的22个群体中21个马铃薯腐烂茎线虫群体分别采自安徽、北京、山东、江苏、河北、河南、吉林和内蒙古的甘薯病区,另有一个从韩国进口大蒜上获得的茎线虫群体(表1)。

用贝曼漏斗法从寄主植物中分离得到线虫,在显微镜下挑取活力较强的线虫200条左右,放在灭菌的指形管中用0.05%青霉素和0.05%氯霉素(青霉素!氯霉素= 1!1)消毒30m i n,再用灭菌水漂洗3次,然后接到长满半裸镰刀菌的培养基上,在25∀温箱中黑暗培养45d,得到大量纯化好的线虫后放入4∀冰箱中保存[17]。

1.2 线虫DNA的提取线虫DNA的提取参照Peng等[18]的方法进行,略有改动。

挑取5~10头茎线虫放入装有10 L ddH2O的离心管中,在-20∀的冰箱中冷冻,取出后,用75%酒精消毒的玻璃棒,在离心管中转动至冰融化,加入8 L的W LB(w o r m ly sis buffer),3 L蛋白酶K溶液(600 g/mL),10000r/m i n离心30s,-20∀下冷冻30m i n,促进细胞裂解。