危害马铃薯的茎线虫分离鉴定_郭全新

Abstract A nematode popula tion , named De-Chabei , was isolated f rom potato in the Chabei Distr ic t of Zhangjiakou City, Hebei P rovince .I t had be en identifie d as type B or L of Ditylenchus destructor Thor ne based on m or phological and m olecular m ethods.The a mplified products of r DNA-I TS r egions with the universal primers r DNA1/ rDNA2 and the spec if ic pr imer s DdL1/ DdL2 we re 1 130 bp (GenBank accession No.FJ911551) a nd 485 bp , r espectively.The results r eve aled tha t this type of D .destructor has e xisted in the potato-gr owing are as of Hebei pr ovince . Key words potato; Ditylenchus destructor ; mor phologic al ide ntif ica tion ; I TS seque nce analysis
34 ～ 40
7～ 8
12 ～ 16
-
♂
760 ～ 1 350
24 ～ 50
4 ～ 11
11 ～ 21
-
♂
630 ～ 1 300
24 ～ 50
4 ～ 11
11 ～ 21
-
1)De-DX 和 D e-Chabei 群体形态测量值为平均值 ±SD , Th orne 等人 b′值项为 b 值 。
口针长/ μm 11 ±1 12 ±1 10 ～ 14 10 ～ 13 11 ±1 11 ±1 10 ～ 12
· 118 ·
20 10
1 .3 线虫标本的制作与形态测量 线虫的固定脱水方法参照武扬等[ 7] , 封固参照
文献[ 8] 。 选取雌雄虫各 20 条用 Oly mpus BX51 显 微镜及 DP2-BSW 软件拍照并测 量 , 主要测 量特征 值 L , a , b′, c , V 及口针长参照文献[ 8] 。 1 .4 线虫 DNA 提取
马 铃 薯 腐 烂 茎 线 虫 (Di ty lenchus destructor T ho rne)在我国主 要危害甘薯 , 成为我国甘 薯生产 的主要问题 , 王金成等[ 1] 、宛菲等[ 2] 、章淑 玲等[ 3] 对
从我国甘薯上分离获得的马铃薯腐烂茎线虫 I TS 区 序列进行比较 , 发现其种群内存在差异 , 依据 IT S1 区域序列长短可分为 A 、B 群体或称 S 、L 群体 , 侵染 甘薯的优势群体为 A 或 S 群体 , 其 IT S1 区缺失 188 bp , 但也有 IT S 区序列与国外报道的马铃薯腐烂茎 线虫一致的 B 或 L 群体[ 1-5] 。 近年来发现马铃薯腐 烂茎线虫在我国也危害马铃薯[ 6] , 从我国河北张北
Identification of Ditylenchus destructor from potatoes in Zhangjiakou , Hebei
Guo Quanxin , Jian Heng
(Department of Plant Pathology , China Agricultural University , Beijing 100193, C hina)
36 卷第 3 期
郭全新 等 :危害马铃薯的茎线虫分离鉴定
· 119 ·
薯上分离到的 9 个线虫样品为 B 型或 L 型马铃薯茎 线虫 。
种群 D e-DX D e-Chabei Tho rn e, 1945 G oodey , 1952 Brz es ki , 1991 D e-DX D e-Chabei Tho rn e, 1945 G oodey , 1952 Brz es ki , 1991
2 结果与分析
2 .1 症状观察 症状描述 :受害马铃薯表皮初常见斑点状 , 中部
可见到小孔 , 后呈现圆形或近圆形疮疤 , 病斑凹陷于 薯块表面(图 1a)。 切除病部表皮 , 病部组织中部有 干的白色物 , 其周围组织变褐 、变干 , 最外周组织变 软呈水渍状(图 1b)。 病斑由外而内常呈漏斗状 , 深 约 1 cm 。这与刘先宝等人报道的马铃 薯被害状基 本一致 。
反应结束后 取 5 μL 产 物加 1 μL 6 ×Loading buff er 在 1 %琼脂糖凝胶上电泳 , 电泳后观察 、照相 。 1 .6 克隆 、测序
分别将通用引物扩增产物 1 000 、1 200 bp 左右 片段 , 以及特异性引物 250 、500 bp 左右片段回收后 连接在 pM D18-T 载体上 , 转化大肠杆菌感受态 , 将 阳性克隆送 Invit rogen 公司测序 。
送检样品中选取病薯 9 个(样品编号为 1 ～ 9), 切取病部组织 , 用浅盘法分离 、收集线虫 。按照 Fer-
m ent as 公司 Genomic DNA Purificatio n Kit 提取 9 个线虫样品 DNA 。 1 .5 线虫 rDNA-ITS 扩增
参照 Wendt 等的 报 道[ 9] , 选 用 通用 引 物 rDNA 1 :5′-T T GA T T ACGT CCCT GCCC T T T-3′ 和 rDNA2 :5′-T T TCAC T CGCCG T T ACT AAGG-3′扩 增待鉴定线虫的 rD N A-I TS , 同 时用宛菲等[ 2] 报道 的马铃薯茎 线虫 A 型特异 性引 物 DdS1 :5′-T CGT AGAT CGAT GAAGAACGC-3′和 DdS2 :5′-ATT A TC T CGAG TGGGAGCGC-3′及 B 型特异性引物 DdL1 :5′-T T GT GT T TGC TGGT GCGC T TG T-3′和 DdL2 :5′-GAGT GAGAGCGAT G T CAACA T TG-3′ 进行验证 。引物由 Invit rogen 公司合成 。
反应体系 :2 .5 μL 10 ×PCR buff er , 2 μL dN T P (2 .5 mmo l / L), 引物各 0 .5 μL (10 mmo l/ L), DNA
模 板 1 μL , Taq DNA po ly merase (2 .5 U/ μL ) 0 .25 μL 。通用引物扩增条件 :94 ℃ 3 mi n 预变性 , 32 个循环(94 ℃30 s 变性 , 45 ℃30 s 退火 , 72 ℃延 伸 90 s), 72 ℃ 10 mi n , 4 ℃∞。 B 型特异性引物退 火温度为 47 ℃, 延伸时间与 A 型特异 性引物均为 60 s , 余皆相同 。
图 1 马铃薯腐烂茎线虫危害马铃薯的症状(a:外表 ;b :内部)
2 .2 形态特征测量 通过测量比较 表明 , 侵染马 铃薯的 De-Chabei
线虫群体与北京大兴区侵染 甘薯的群体 De-DX 形 态特征 值 一 致 , 也 与 刘 维 志 等 人 鉴 定 的 结 果 一 致[ 10] 。 De-Chabei 线 虫 群 体 与 T ho rne[ 11] 、G o odey[ 12] 、Brzeski[ 13] 等人 的 报道 基 本一 致 , 但 b′值 与 T ho rne 报道的有一定差别 , 因此从张家口市察北区 马铃薯上分离的线虫初步确定为马铃薯腐烂茎线虫 (Di ty lenchus destructor T ho rne)。
2010 , 36(3):117-120
P lant Protection
危害马铃薯的茎线虫分离鉴定 ＊
郭全新 , 简 恒＊＊
(中国农业大学植物病理系 , 北京 100193)
摘要 本文对采自河北张家口市察北区 、危害马铃薯的线虫(编号 De-Chabei)进行了 形态及分 子生物学 鉴定 , 形态 测量结果表明其与马铃薯腐烂茎线虫(Dity lenchus destructor T hor ne)一致 , 采用通用引物 r DN A1/ r DN A2 扩增 rDNA-I TS 区的长度为 1 130 bp , 测序比 对以及采用马铃薯茎线虫 B 型 特异性引物 DdL1/ DdL2 扩增得到 485 bp 特异 性片段 , 表明与 B 型或 L 型马铃薯腐烂茎线虫一致 ;再次证明该型线虫 在河北马铃薯主产区的分布和危害 。 关键词 马铃薯 ; 马铃薯腐烂茎线虫 ; 形态鉴定 ; IT S 区分析 中图分类号 : S 435 .32 文献标识码 : A DOI: 10 .3969/ j .issn .0529-1542 .2010.03 .028
78 ～ 83
♀
690 ～ 1 890
18 ～ 49
4 ～ 12
9 ～ 30
73 ～ 90
♀
690 ～ 1 890
18 ～ 49
4 ～ 12
14 ～ 20
77 ～ 84
♂
932 ±96
44 ±7
14 ±1
13 ±1
93 ±20
♂
870 ±92
38 ±5
14 ±2
14 ±1
93 ±21
♂Байду номын сангаас
890 ～ 1 300
县马铃薯上首次发现的马铃薯腐烂茎线虫为 B 或 L 类群 。最近 , 作者从河北张家口地区的马铃薯上再 次发现线虫危害 , 为此 , 本研究对分离到的线虫进行